骨髓间充质干细胞与背根神经节神经元共培养模型的建立

发布时间：2019-10-28 11:18

【摘要】：第一部分SD大鼠Schwann细胞、DRGn、BMSCs原代培养 【目的】建立一系列（包括SD大鼠Schwann细胞、DRGn、BMSCs）取材容易、细胞存活时间长、纯度高的、培养稳定的原代培养模型，为后续细胞共培养实验的准确性提供保障。 【方法】1.SD大鼠Schwann细胞原代培养：取15只出生1天的SD乳鼠，在体视解剖显微镜下获取坐骨神经和臂丛神经，联合应用I型胶原酶和胰酶进行消化，使用含有刺激因子forskolin和牛垂体提取物（BPE）的F12/DMEM1:1培养基联合抗有丝分裂药物和无血清培养纯化等方法获得Schwann细胞。采用雪旺氏细胞标志物S100蛋白免疫细胞化学染色法和hoechst染核鉴定并测定Schwann细胞的纯度。2.SD胎鼠DRGn原代培养：在解剖显微镜下取得E16（怀孕第16天）胎鼠背根神经节，通过胰蛋白酶消化，使用无血清培养基联合抗有丝分裂来获得高纯度的DRG神经元。采用NF200细胞免疫荧光鉴定DRGn和纯度检测。3.SD大鼠BMSCs原代培养：将大鼠的股骨和胫骨在动物房手术台取出，转移入细胞原代培养超净台中用剪刀把股骨和胫骨从中间剪断，冲洗骨髓腔获得骨髓，通过贴壁和传代培养来纯化BMSCs，培养至第8代（P8）的BMSCs用流式细胞检测技术检测表面抗原CD29，CD44,CD45的表达率来鉴定骨髓间充质干细胞和计算其纯度。【结果】1.SD大鼠雪旺氏细胞原代培养：雪旺氏细胞在含有 forskolin和牛脑垂体提取液的F12/DMEM1:1培养基中生长良好，生长速度快，纯度可达到98%以上。2.SD胎鼠DRGn原代培养：原代培养的DRGn在含有神经生长因子（NGF）的NB培养基中生长良好，存活时间可达45d，纯度可达到95%以上。3.SD大鼠BMSCs原代培养：在传到第8代时，可以得到纯度较高的BMSCs，此时经流式细胞仪分析，P8代BMSCs表达抗原具有很高的均一性，CD29和CD44强阳性表达，而CD45只有很少的表达，说明培养的BMSCs可以满足本实验及后续研究的需要。【结论】本实验所培养的原代SD大鼠Schwann细胞、DRGn、BMSCs细胞活性良好，纯度高，适用于共培养实验。一、慢病毒介导GFP绿色荧光蛋白标记BMSCs 【目的】探讨慢病毒感染BMSCs介导GFP标记大鼠BMSCs的适宜条件，以获得稳定高表达绿色荧光蛋白的BMSCs。为共培养实验的动态观察奠定基础。 【方法】用携带GFP基因的载体质粒和包装质粒同时转染至293T细胞，质粒在细胞内组装含GFP的慢病毒，随后对慢病毒进行滴度检测，分别以MOI值为10，20，40感染BMSCs细胞，倒置荧光显微镜观察各组的感染效率和荧光强度以及转然后的形态变化，MTT法检测慢病毒感染对BMSCs增殖的影响，从而确定适宜的感染条件。 【结果】MOI=10转染效率为（62.2±2.3）%，MOI=20转染效率为（93.2±1.8）%,MOI=40转染效率无明显增加。感染对BMSCs增殖无影响。 【结论】MOI值为20是慢病毒载体介导GFP标记BMSCs的适宜条件，GFP绿色荧光蛋白能在BMSCs中稳定表达，BMSCs的增殖分化不受影响【关键词】慢病毒，GFP，，BMSCs，MOI 二、BMSCs与DRGn共培养 【目的】建立GFP标记的BMSCs与DRGn共培养模型。 【方法】GFP绿色荧光蛋白标记的BMSCs与DRGn共培养，荧光显微镜下观察BMSCs诱导分化Schwann细胞样细胞的时间和数量。 【结果】GFP标记的BMSCs与DRGn共培养3天后可观察到Schwann细胞样细胞出现；共培养7天后能观察到典型的Schwann细胞样细胞出现。随着共培养时间的延长Schwann细胞样细胞数量逐渐增多。 【结论】DRGn能诱导BMSCs分化成Schwann细胞样细胞，此模型可以用于BMSCs向Schwann细胞样细胞分化的研究。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 王红;周晓巍;张宏;黄培堂;;鞘内注射ω-芋螺毒素S03对大鼠慢性神经痛的镇痛作用及对DRG细胞内Ca~(2+)含量的影响[J];中国药理学通报;2006年06期

2 王灿;陈素;刘向明;;龙血素B抑制大鼠背根神经节细胞辣椒素诱发的电流反应[J];中国药理学通报;2007年02期

3 劳杰,熊良俭,顾玉东,黄慧思;改良成年SD大鼠雪旺细胞培养的实验研究[J];中华手外科杂志;1999年02期

本文编号：2553083