银杏内酯B对HIBD新生大鼠脑细胞凋亡的影响及其机制研究

发布时间：2019-11-17 22:13

【摘要】：目的通过制备新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic ischemic brain damage,HIBD)实验动物模型,同时给予中药银杏内酯B(Ginkgolide B,GB)、PI3K-AKT信号通路抑制剂(LY294002)、MEK-ERK信号通路抑制剂(U0126)进行干预,观察HIBD后各组大鼠脑源性神经生长因子(Brain-derived neutrophic factor,BDNF)、磷酸化-AKT(ser473)[P-AKT(ser473)]、磷酸化-ERK1/2(P-ERK1/2)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3,CC3)的表达水平及神经细胞凋亡情况,探讨银杏内酯B对HIBD后新生大鼠脑BDNF表达的影响,以及PI3K-AKT/MEK-ERK信号传导通路在银杏内酯B抗HIBD新生大鼠神经细胞凋亡中的作用,以期为缺氧缺血性脑损伤治疗开辟新途径和新思路,减少HIBD后遗症的发生。方法首先将160只SPF级新生7日龄SD大鼠按随机数字表法分4组:假手术组(Sham组)、缺氧缺血组(HI组)、GB_(低剂量组)(10mg/Kg)和GB_(高剂量组)(20mg/Kg),其中,GB治疗组于缺氧缺血后0h、24h经腹腔给药,且各组分别于术后不同时间点(6h、12h、24h、48h)随机处死大鼠各10只,断头取脑,采用聚合酶链反应法检测BDNFmRNA及Caspase-3mRNA的表达水平,筛选出效应强度最佳时间点,即为缺氧缺血后24h,且GB_(高剂量组)效果优于GB_(低剂量组)。然后将另外140只SD大鼠按随机数字表法分为7组:假手术组(Sham组)、缺氧缺血组(HI组)、GB组(20mg/Kg),LY294002组、GB+LY294002组、U0126组、GB+U0126组,每组各20只。其中,LY294002组和GB+LY294002组均于造模前30min给予LY294002(1.8mg/Kg),U0126组和GB+U0126组均于造模前30min给予U0126(0.2mg/Kg);参照经典Rice法制备HIBD实验动物模型,GB组、GB+LY294002组和GB+U0126组均于造模后即刻经腹腔注射银杏内酯B(20mg/Kg),然后各组于缺氧缺血后24h断头取脑。苏木精-伊红染色法(HE染色)观察脑白质病理改变,原位切口末端标记法法(TUNEL)检测脑神经细胞凋亡情况,同时分别采用免疫组化和Western blotting对脑组织中BDNF、P-AKT(ser473)、P-ERK1/2及CC3蛋白进行定位和定量。数据以sx±表示,采用SPSS17.0软件包进行统计分析,定量资料多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t法,以α=0.05为检验水准。结果1聚合酶链反应(PCR)结果银杏内酯B可抑制缺氧缺血后不同时间点大鼠脑组织Caspase-3mRNA上调,同时促进缺氧缺血后BDNFmRNA表达,发挥神经保护功能。具体结果如下:与Sham组比较,缺氧缺血后6 h HI组和两治疗组大鼠脑Caspase-3mRNA开始出现升高,BDNFmRNA开始下降;12h Caspase-3mRNA进一步上升,BDNFmRNA进一步下调,至24 h分别达到峰值和谷值,随后Caspase-3mRNA呈下调趋势,BDNFmRNA也有所回升。但各时间点两治疗组Caspase-3mRNA水平均低于HI组,BDNFmRNA水平均高于HI组,且HIBD后24h差距最明显,GB_(高剂量组)效果优于GB_(低剂量组)。2苏木精-伊红染色(HE)结果银杏内酯B可减轻HIBD新生大鼠神经细胞水肿。具体结果如下:Sham组神经细胞形态结构基本正常,胞浆、胞核分别被染成粉红色与深蓝色;缺氧缺血后24 h,HI组神经细胞水肿较为明显,呈空泡样或气球样改变,同时可见炎性细胞浸润,血管内皮细胞明显肿胀;GB治疗组(20mg/kg)细胞水肿有所减轻,仅少部分细胞出现水泡样改变。3原位切口末端标记法(TUNEL)结果银杏内酯B可减轻HIBD新生大鼠神经细胞凋亡。具体结果如下:Sham组仅可见个别凋亡细胞;与Sham组比较,HI组和GB组(20mg/kg)凋亡细胞计数增加,差异有统计学意义(P0.01);与HI组比较,GB组凋亡细胞计数有所降低,差异亦有统计学意义(P0.01)。4免疫组织化学结果银杏内酯B可抑制缺氧缺血诱导的CC3阳性细胞计数增加,同时上调BDNF和P-AKT(ser473)阳性细胞计数,减少缺氧缺血性脑损伤后神经细胞凋亡水平,且这一作用可被LY294002抑制剂所抑制。具体结果如下:与Sham组比较,HI组大鼠脑BDNF和P-AKT(ser473)阳性表达细胞减少,而凋亡因子CC3阳性表达细胞增多,差异均有统计学意义(P0.05);此外,与HI组比较,GB组(20mg/Kg)BDNF和P-AKT(ser473)阳性细胞增多,CC3阳性细胞减少,差异亦均有统计学意义(P0.05);然而,各组间大鼠脑P-ERK1/2阳性细胞计数均较少,且差异无统计学意义(P0.05)。与GB(20 mg/kg)治疗组比较,LY294002组和GB+LY294002组大鼠脑BDNF和P-AKT(ser473)阳性细胞减少,CC3阳性细胞增多,差异均有统计学意义(P0.05);而LY294002组和GB+LY294002组相比,上述蛋白阳性细胞计数差异无统计学意义(P0.05)。与U0126组比较,GB组和GB+U0126组大鼠脑BDNF阳性表达细胞增多,而CC3阳性表达细胞减少,差异均有统计学意义(P0.05);与GB组比较,GB+U0126组BDNF及CC3阳性细胞计数无明显变化,而P-ERK1/2阳性细胞数减少,差异有统计学意义(P0.05)。5蛋白印记结果银杏内酯B可抑制缺氧缺血诱导的CC3蛋白表达水平增加,同时上调脑组织中BDNF和P-AKT(ser473)蛋白表达水平,发挥抗缺氧缺血脑损伤神经细胞凋亡的作用,且这一作用可被LY294002抑制剂所抑制;而P-ERK1/2蛋白表达水平对银杏内酯B功能的发挥无明显的影响。具体结果如下:与Sham组比较,HI组大鼠脑BDNF及P-ATK(ser473)蛋白表达有所下调,凋亡因子CC3表达明显上调,差异均有统计学意义(P0.05);与HI组比较,GB组(20mg/Kg)大鼠脑BDNF及P-ATK(ser473)蛋白表达量增多,CC3蛋白表达有所减低,差异亦均有统计学意义(P0.05);然而,以上各组P-ERK1/2蛋白表达水平均较低且无明显变化趋势;与GB组(20mg/Kg)相比,LY294002组和GB+LY294002组大鼠脑BDNF和P-AKT(ser473)蛋白表达量明显降低,凋亡因子CC3蛋白含量明显升高,差异均具有统计学意义(P0.05),而LY294002组和GB+LY294002组相比,上述蛋白的表达量无明显变化,差异不具有统计学意义(P0.05);与U0126组比较,GB和GB+U0126两组大鼠脑BDNF和P-AKT(ser473)蛋白表达水平均上调,凋亡因子CC3蛋白表达水平均下调,差异具有统计学意义(P0.05);而U0126组和GB+U0126组大鼠脑P-ERK1/2蛋白表达水平极低,与GB组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。结论1银杏内酯B能够抑制缺氧缺血后新生大鼠脑组织Caspase-3mRNA上调及BDNFmRNA下调,且于HIBD后24h抑制程度最明显,GB_(高剂量组)效果优于GB_(低剂量组);2银杏内酯B能够下调缺氧缺血后新生大鼠脑CC3蛋白表达水平,减轻脑损伤后神经细胞凋亡;3银杏内酯B能够促进HIBD后新生大鼠脑BDNF分泌,发挥神经保护作用;4 PI3K/AKT信号通路在银杏内酯B抗缺氧缺血性脑损伤新生大鼠神经细胞凋亡的过程中起着重要作用;而MEK/ERK信号通路对银杏内酯B神经保护作用的发挥无明显的影响。
【图文】：

细胞凋亡

2图 1.1 细胞凋亡的信号传导机制图 1.2 生长因子拮抗细胞凋亡的相关机制加剧海马神经细胞凋亡。Kokaia 等人[10]通过观察比较缺血损伤后海马不同区域BDNF 表达水平与抗缺血能力之间的关系，也证实了内源性神经生长因子的保护功能。Schabitz 等学者[6]发现 BDNF 能明显降低大鼠大脑中动脉闭塞后脑梗死面积及 Bcl-2、Bax 阳性表达细胞计数。此外，BDNF 能显著促进大鼠暂时性前额缺血后海马 CA1 区锥形神经元的存活[11]。以上功能主要与细胞表面 2 个重要受体即酪氨酸激酶受体 B（TrkB）和神经营养因子受体 p75 的活化有关[4]，并且前者的激活是该功能必不可少的环节[12]。国外许多体外细胞实验表明：BDNF 与 TrkB 受体结合后可通过激活MEK-ERK 通路或 PI3K-AKT 通路来发挥抗神经元凋亡作用[13]，这与神经细胞类型、损伤因素及培养条件有关[14]。此外，动物实验研究也表明：BDNF-TrkB-PI3K/AKT 通路在血红素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）及

相关机制,拮抗,生长因子,细胞凋亡

2图 1.1 细胞凋亡的信号传导机制图 1.2 生长因子拮抗细胞凋亡的相关机制加剧海马神经细胞凋亡。Kokaia 等人[10]通过观察比较缺血损伤后海马不同区域BDNF 表达水平与抗缺血能力之间的关系，也证实了内源性神经生长因子的保护功能。Schabitz 等学者[6]发现 BDNF 能明显降低大鼠大脑中动脉闭塞后脑梗死面积及 Bcl-2、Bax 阳性表达细胞计数。此外，BDNF 能显著促进大鼠暂时性前额缺血后海马 CA1 区锥形神经元的存活[11]。以上功能主要与细胞表面 2 个重要受体即酪氨酸激酶受体 B（TrkB）和神经营养因子受体 p75 的活化有关[4]，并且前者的激活是该功能必不可少的环节[12]。国外许多体外细胞实验表明：BDNF 与 TrkB 受体结合后可通过激活MEK-ERK 通路或 PI3K-AKT 通路来发挥抗神经元凋亡作用[13]，，这与神经细胞类型、损伤因素及培养条件有关[14]。此外，动物实验研究也表明：BDNF-TrkB-PI3K/AKT 通路在血红素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）及
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742

【参考文献】