组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对脑缺血保护作用的机制研究

发布时间：2019-11-21 13:18

【摘要】：第一部分去乙酰化酶抑制剂SAHA对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用目的:探讨去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitors,HDACis)辛二酰苯胺异经肟酸(Suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对小鼠缺血再灌注性脑损伤的保护作用及其可能的分子机制。方法:健康雄性BALB/c小鼠随机分为4组:假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、SAHA组、溶剂对照组(DMSO)。I/R组采用改良Zea-Longa线栓法建立小鼠大脑中动脉缺血60min后再灌注24h的损伤模型。SAHA组为三个亚组,分别于再灌注时尾静脉注射不同浓度的SAHA100μl(SAHA1组12.5mg/Kg;SAHA2 组 SAHA 25mg/Kg;SAHA3 SAHA 50mg/Kg)。DMSO组:再灌注时尾静脉注射100μl25%DMSO。再灌注后24h进行神经功能缺陷评分,此后处死小鼠,TTC染色观察脑梗死体积、Western blot检测脑组织蛋白的乙酰化水平。结果:缺血再灌注24h,I/R组和SAHA组均出现不同程度的神经功能障碍,神经功能缺陷评分在1-3分之间,Sham组无神经功能缺陷。与DMSO组相比,25mg/kg及50mg/kg SAHA均能显著改善神经功能障碍症状,减小脑梗死体积,与II/R组相比差异有统计学意义(P0.01)。Western blot结果显示,I/R组小鼠缺血侧大脑的乙酰化水平较Sham组明显下降。SAHA处理可使正常小鼠脑蛋白的乙酰化增高,缺血再灌注后立刻给予25mg/Kg和50mg/Kg的SAHA,可显著抑制脑缺血诱导的乙酰化水平下降(P0.05)。结论:小鼠缺血再灌注后予SAHA处理可以改善神经功能缺损,减少脑梗死体积,提高蛋白的乙酰化水平,具有一定的脑保护作用。第二部分去乙酰化酶抑制剂SAHA对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用的定量蛋白质组学研究目的:在前期SAHA对小鼠MCAO模型脑缺血损伤保护作用研究的基础上,通过基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学方法探讨其对缺血再灌注性脑损伤保护作用的可能分子机制。方法:线栓法建立小鼠局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO);采用iTRAQ稳定同位素标记和2D nanoLC/MS/MS的定量蛋白质组学方法检测差异表达蛋白,Gene ontology(GO)分析差异表达蛋白的生物学功能,IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析与差异蛋白相关的生物学途径,并通过Western blot和ICC验证蛋白质组学的检测结果。结果:本研究分为Sham组、SAHA处理的Sham组、MCAO组、SAHA处理的MCAO组。通过与Sham组相比,分析缺血和SAHA处理对脑蛋白质表达谱的影响,与缺血组相比分析SAHA处理对缺血脑蛋白表达谱的影响。在所检测的样本中共鉴定到1577种蛋白质(FDR1%),其中1117种蛋白具有2条或2条以上的肽段,1113种蛋白具有定量信息。缺血再灌注组与假手术组相比,68种蛋白质的表达发生显著变化(增加或降低1.5倍),其中上调的蛋白33种,下调的35种。上调的主要是血液的蛋白成分(HEMO,HPT和FIBG等)、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异表达的蛋白(GFAP,EAA2和MAG等),下调的蛋白包括细胞骨架成分(Tau),参与蛋白合成和修饰的蛋白(EF1A1,ALG2),转运相关蛋白(CAMKV,S12A5,VPS52)。与缺血再灌注相比,SAHA的处理改变了部分缺血再灌注组差异蛋白的变化趋势,缺血后增加的33种蛋白中有14种被下调,而34种下降的蛋白中则有19种被上调,这也是本研究最重要的发现。Western blot验证了 4种因SAHA处理而改变变化趋势的蛋白:GFAP,EAA2,Tau和GSK3β。结论:本研究首次从蛋白质组的层面展现了 HDACi对脑缺血再灌注损伤所具有的多重保护作用,包括:1、保护血脑屏障,2、降低胶质细胞活化,3、稳定细胞和组织结构,4、改善能量代谢。这不仅证实了已有的研究结果,更重要的是,SAHA的处理可以部分改变缺血对脑蛋白表达影响的趋势,这有可能是SAHA对脑缺血损伤多重保护作用的重要原因。此外,星形胶质细胞也被发现参与了 SAHA对脑缺血的保护作用。
【图文】：

ＶＰＡ）和４苯下酸钢（ｓｏｄｉｕｍ４－ｐｈｅｎｙＩｂｕｔｙｒａｔｅ，邋４ＰＢＡ），另一类是含有异哲朽酸逡逑的邋ＨＤＡＣｉ，如曲古抑滴素（ｔｒｉｃｈｏｓ包加邋Ａ，邋ＴＳＡ））和邋ＳＡＨＡ邋（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎ化ｄｅ逡逑ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃａｃｉｄ），它们都是非特异性的泛去己憸化酶抑制剂（图１）。最近的在逡逑８逡逑

要阐明非特异性ＨＤＡＣｉｓ的特异性神经保护作用的分子机制就必逡逑须考虑到ＨＤＡＣｉｓ对蛋白表达（转录）和蛋白乙憸化修饰（非转录）两方面的影逡逑响，，并评估二者在此过程中的贡献（图２）。由于卒中是一极其复杂的病理生理逡逑过程，而蛋白质的石酷化又具有广泛的调节作用，传统的还原论方法很难描述逡逑与分析ＨＤＡＣｉｓ对缺血神经元保护作用过程中复杂的分子事件，因此有必要采用逡逑系统生物学的方法来全面解析这一过程。逡逑基于质谱技术的蛋白质组学方法是目前研巧包括己憸化在内的多种蛋白质逡逑翻译后修饰（ＰＴＭｓ）最有力的工具。本研究巧建立原代培养大鼠皮层神经元细逡逑胞的体外缺血模型，亲和层析富集己憸化肤段，采用基于ｉＴＲＡＱ〔ｉｓｏｂａｒｉｃ扫ｇ化ｒ逡逑ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ａｎｄ邋ａｂｓｏｌ山：ｅ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ邋）稳定同位素标记和在线二维纳流液相结合串逡逑联质谱技术（ｏｎｌｉｎｅ邋２Ｄ邋ｎａｎｏ邋ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）的差异蛋白质组学方法，检测泛立憸逡逑１２逡逑
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3

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本文编号：2564022