选择性免疫调节干预脑出血的前临床探索

发布时间：2019-11-21 22:31

【摘要】：研究背景及目的:脑出血作为脑卒中的一种亚型,通常指血管破裂所引起的脑实质内出血,常引起很高的致死率和致残率。截至目前,尚缺乏有效的治疗手段。随着人口老龄化的加重,更需要引起重视。脑出血病理机制复杂,初级损害常常由血肿引起的机械占位效应引起,继而引发次级损害,即由血肿周围的水肿所引发的占位效应、炎症、凋亡和坏死导致。针对初级损害目前尚缺乏有效的治疗手段,而针对脑出血后脑水肿所引发的不良结果,目前已有一些研究表明针对其干预的有效性,尤其是脑出血后炎症免疫反应在脑损伤中的作用,可作为可能有效的干预靶点。磷脂酰鞘氨醇1(S1P)作为G蛋白偶联受体调节剂具有S1P1-S1P5这5个亚型,在细胞内和细胞外调节过程中均发挥重要作用。新近研究表明芬戈莫德(FTY720)作为口服治疗多发性硬化的非选择性S1P受体调节剂能够改善实验动物和患者脑出血后的神经功能缺损并减轻脑水肿,并主要通过S1P1受体发挥作用。同时,一些研究也表明其非选择性的调节作用也可能引起不良反应。RP101075作为选择性S1P1受体调节剂具备优越的特异选择性和良好的心血管安全性。本实验旨在研究特异性选择性免疫性调节S1P1受体在实验性脑出血模型中的治疗作用及可能的机制探索。研究方法:本实验分别采用C57BL/6小鼠和Rag2~(-/-)小鼠作为实验对象,采用自体血注射诱导脑出血模型。脑出血小鼠随机分成假手术组、安慰剂治疗组、RP101075治疗组、RP101075和W146(S1P1受体阻滞剂)共同治疗组和FTY720治疗组,采用灌胃的给药方式连续给药3天,并从术后30分钟后开始给药,每天给药一次,并在术后相应时间点应用改良神经功能评分、转角实验、前爪放置实验对实验鼠进行神经功能评价,同时包括14天的生存率评价,利用核磁、干湿重方法评价脑水肿,应用核磁评价血肿体积,血红蛋白定量测定脑血肿含量,并应用流式细胞术、免疫荧光、酶联免疫吸附试验测定脑内和外周的免疫炎性细胞浸润,包括小胶质细胞、星形胶质细胞、中性粒细胞、白细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、NK细胞、B细胞、炎症因子TNF-α、IL-1β表达,应用伊文斯兰定量定性测定血脑屏障渗漏和蛋白印迹法检测紧密连接蛋白表达,以及体内体外对神经元凋亡的检测。研究结果:选择性S1P1受体调节剂RP101075能够有效改善脑出血小鼠的神经功能缺损、生存率和脑水肿。W146能够阻滞RP101075在脑水肿和神经功能方面的治疗作用。同时,RP101075能够减少小鼠脑出血后脑内和外周淋巴细胞、中性粒细胞、小胶质细胞浸润和炎症因子表达,并且能够提高血脑屏障完整性、减少神经元凋亡。研究结论:研究表明选择性S1P1受体调节剂RP101075能够在实验性脑出血中提供神经保护功能,同时鉴于其药理学方面的优势,说明利用RP101075选择性调节S1P1受体在实验性脑出血中具备有效的治疗作用和转化研究价值,值得进一步研究。
【图文】：

图 1. 小鼠脑出血模型采用改良取血注射方法，将小鼠内眦取血 30 微升，然后迅速将 30 微升未凝固的血液转移到微量注射器的针筒中，针头的规格为 26G，并确保针头血液流畅，然后固定于注射泵上。将取血后的小鼠俯卧固定于立体定位仪，剃去头顶处毛发后，采用碘伏擦拭消毒，并用手术刀沿中线切开约 1 厘米的切口，擦拭掉软组织后，找到前囟点，，作为原点，并在前囟点的前方 0.3 毫米、右侧 2.5 毫米处标记注射点，然后用钻头钻开一个直径约 1 毫米的注射孔后，将固定好的微量注射注射器针头沿注射孔进入脑实质，深度确定为 3.5 毫米，注射速度为每分钟2 微升，采用双次注射方法，第一次注射量为 5 微升，然后稍作停留，然后继续以每分钟 2 微升的速度缓慢注射，注射完成后，停针约 20 分钟左右，然后分 3次取出针头，每次 1 毫米，取出注射针头后，消毒伤口，缝合伤口。假手术组用同样的针头刺入相同位置相同深度但不注入血液。

图 2. 实验流程图在制作脑出血模型前，对基线期小鼠的神经功能进行评价作为对照。采用自体血注射基底节区小鼠脑出血模型，注射 30 微升自体血，术后 30 分钟开始采用灌胃方式给予溶剂、RP101075、RP101075+W146 干预，连续给药 3 天。在术后第 1 天，进行神经功能评价，包括 mNSS 评分、前爪放置实验、转角实验。同时进行核磁扫描，包括 SWI 序列和 T2 序列，评价血肿体积和脑水肿。同时进行大体测量和血红蛋白定量测定血肿体积和脑血红蛋白含量测定，应用干湿重评价脑水肿情况。并运用流式细胞术、免疫荧光、酶联免疫吸附实验评价脑内、外周血和脾的免疫炎症情况。术后第 3 天，神经功能、脑水肿、血肿和免疫情况测量同术后第一天，并同时应用伊文斯蓝测定血脑屏障渗漏，应用蛋白印记检测紧密连接蛋白表达，同时检测细胞凋亡情况。整体观察术后 14 天生存率。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.34

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本文编号：2564192