间断缺氧预处理对氯化锂—匹鲁卡品致痫大鼠保护作用的机制研究

发布时间：2019-11-24 11:08

【摘要】：癫痫性发作定义为“由于过度的同步化的大脑神经元活动而导致的一种短暂的征兆和/或征象。”一群神经元突发,暂时性同步化活动的原因尚不明确。大量研究表明干扰脑的能量代谢与颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy,TLE)的病理生理相关,而星形胶质细胞最重要的功能就是维护大脑能量自稳态。对这一状况的更好地了解将提供给神经科学家和内科医师关键性的信息从而使其能够开发出对患者有益的进一步的治疗措施。预处理指的是细胞,器官或者有机体暴露于亚致死的损伤而产生的对随后严重损伤保护作用。接近且低于细胞损伤阈值的伤害性刺激诱导产生适应性反应从而保护器官抵抗进一步的同种损伤(耐受)或者不同损伤(交叉耐受)刺激。尽管发现癫痫预处理,轻微的癫痫发作能够保护神经元抵抗后续癫痫持续状态(Status epilepticus,SE),也能保护神经元抵抗缺血。但很少有研究关注是否缺氧/缺血预处理也能够对神经元提供保护作用而抗癫痫。缺血/缺氧时,星形胶质细胞释放的乳酸在能量危机时被神经元吸收作为能量。主要在星形胶质细胞上表达的单羧酸转运体-4(Monocarboxylate transporter 4,MCT4)的生理角色与这一过程密切相关。哺乳动物体内普遍表达的低氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)是重要转录因子之一,其通过对缺血/缺氧的及时应答以保持体内氧平衡。缺血/缺氧信号刺激HIF-1α上调,进而调控多种下游靶基因,通过促进红细胞和血管新生,达到改善组织缺血/缺氧的目的。MCT4基因恰好是HIF-1α的众多靶基因之一。本研究的目的在于证明以下假设,缺氧预处理可以通过上调MCT4的表达为神经元提供保护而起到抗癫痫作用。通过形态学,分子生物学和行为学的方法比较了缺氧处理对培养原代大鼠星形胶质细胞及间断缺氧预处理(Intermittent hypoxia preconditioning,IHP)对氯化锂-匹鲁卡品癫痫模型大鼠的作用。结果表明缺氧会明显上调原代培养星形胶质细胞的MCT4,间断缺氧预处理5日可以为癫痫模型大鼠提供最强大的抗癫痫作用。这一保护作用在标准化间断缺氧预处理后第3日最为明显。本实验分为以下四个部分:第一部分:糖氧剥夺处理对离体培养原代大鼠海马星形胶质细胞MCT4表达的影响目的:通过对SD大鼠原代海马星形胶质细胞的免疫印迹和免疫细胞化学分析,对比正常或缺氧条件下MCT4在星形胶质细胞上的表达情况。方法:培养的星形胶质细胞随机分为对照组与缺氧组。缺氧组细胞进行糖氧剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)处理8h。恢复至正常培养条件下24小时后,培养皿中细胞收集进行MCT4的免疫印迹检测,爬片上的细胞双标MCT4和星形胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)。结果:免疫印迹及双标免疫荧光染色均表明,经过8小时的OGD处理,缺氧组星形胶质细胞的MCT4表达水平较对照组明显升高(P0.05)。结论:缺氧处理可以明显诱导培养的原代星形胶质细胞上MCT4表达上调。第二部分:间断缺氧预处理对大鼠海马MCT4及HIF-1α表达的影响目的:通过对不同间断缺氧预处理周期SD大鼠海马MCT4、HIF-1α,GFAP及神经元抗核抗体(neuronal nuclei,Neu N)的免疫印迹、双标免疫荧光及免疫组化分析,确定标准化大鼠间断缺氧预处理周期。方法:36只大鼠被随机均分对照组和5个间断缺氧预处理组。间断缺氧预处理组大鼠分别给予间断缺氧预处理1d,3d,5d,7d和14d。预处理结束后24h,每组3只大鼠取海马进行MCT4和HIF-1α的免疫印迹检测,另3只大鼠取鼠脑免疫荧光双标MCT4、GFAP和Neu N。结果:免疫印迹分析表明IHP组HIF-1α表达峰值出现在IHP 3d时间点,MCT4表达的峰值出现稍显滞后在5d时间点,随后二者表达逐渐下降。相比对照组及IHP 14d组,HIF-1α表达在IHP 3d组升高最为明显(P0.05),MCT4表达在IHP 5d组升高最为明显(P0.05)。大鼠海马CA1区MCT4的免疫荧光标记与免疫印迹分析的变化趋势一致。然而,海马CA1区GFAP及颞叶皮层Neu N的免疫组化染色不会被IHP预处理所影响。结论:间断缺氧预处理会明显诱导海马MCT4和HIF-1α上调,但不会引起器质性脑损伤。因此,间断缺氧预处理5日被确认为本研究中标准化的IHP预处理预处理周期。第三部分:间断缺氧预处理对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠癫痫易感性的影响目的:为了进一步阐明癫痫易感性与大鼠海马MCT4和HIF-1α表达变化之间的关系,对IHP预处理后癫痫模型大鼠进行了电生理监测,行为学观察,免疫印迹和双标免疫荧光分析。方法:99只大鼠随机均分为9组:对照组,癫痫组(仅注射氯化锂-匹鲁卡品诱发癫痫),缺氧预处理组(仅仅进行5天间断缺氧预处理)和6个缺氧预处理-癫痫组。在标准间断缺氧预处理后第1日(IHP-1d seizure组),第2日(IHP-2d seizure组),第3日(IHP-3d seizure组),第5日(IHP-5d seizure组),第7日(IHP-7d seizure组)和第14日(IHP-14d seizure组),各组分别注射氯化锂-匹鲁卡品诱发癫痫。诱发后,癫痫组及6个缺氧预处理-癫痫组的各3只大鼠进行电生理监测4小时,另外8只进行4小时行为学观察。依据改良的Racine评分法每5min进行一次发作行为学评分持续4小时。同时也记录全身性发作达到4级的潜伏期和全身性发作百分比(评级为4和5级占所有评级时间点的百分比)。癫痫诱发后24小时海马MCT4,HIF-1α和GFAP的表达是通过免疫印迹分析以及免疫荧光双标进行评价的。结果:癫痫组大鼠的背景脑电显示出全面强直阵挛性的癫痫样异常包括多棘波异常和棘慢波放电。IHP-3d seizure组大鼠的背景脑电仅出现偶发性的痫样放电。诱发癫痫的改良Racine评分平均峰值在氯化锂-匹鲁卡品注射后50-150分钟之间,然后逐渐消退。IHP-3d seizure组大鼠的平均改良Racine评分明显低于其余各组。IHP-3d seizure组大鼠的全身性发作潜伏期和全身性发作百分比相比癫痫组大鼠的参数,差异具有统计学意义(P0.05)。免疫印迹分析表明与癫痫组相比,MCT4和HIF-1α的表达在单纯IHP组,IHP-3d seizure组以及IHP-5d seizure组均明显上调(P0.05)。免疫荧光双标表明相比癫痫组大鼠海马齿状回(hippocampal Dentate Gyrus,DG)MCT4的表达在IHP-3d seizure组上调最为明显,而GFAP的表达并无变化。结论:标准化的IHP预处理可以通过上调海马区MCT4和HIF-1α的表达而为大鼠提供最大的抗癫痫保护作用。癫痫耐受效果在IHP后第3日最为明显。第四部分:乳酸转运功能的干扰对IHP预处理所诱导的大鼠癫痫耐受的影响目的:为了进一步阐明是否乳酸转运功能的干扰将阻断大鼠癫痫耐受的保护作用,对经历了不同处理的癫痫模型大鼠进行了电生理监测,行为学观察,免疫印迹和双标免疫荧光分析。方法:33只大鼠随机均分为3组:癫痫组(仅注射氯化锂-匹鲁卡品诱发癫痫),间断缺氧预处理-癫痫组(标准间断缺氧预处理后72小时,注射氯化锂-匹鲁卡品诱发癫痫)和间断缺氧预处理-抑制剂-癫痫组(该组大鼠经历与缺氧预处理-癫痫组同样的程序,只是在匹鲁卡品注射前4小时,腹腔注射α-氰基-4-羟基肉桂酸乙酯(CHC,90mg/kg,美国Sigma公司)这是一种特异性的线粒体乳酸和丙酮酸的共价转运抑制剂)。诱发后,各组的3只大鼠进行电生理监测4小时,另外8只进行4小时行为学观察。记录与第三部分相同的行为学参数。癫痫诱发后24小时海马MCT4,HIF-1α和GFAP的表达是通过免疫印迹分析以及免疫荧光双标进行评价的。结果:间断缺氧预处理-抑制剂-癫痫组大鼠的背景脑电同癫痫组一样显示出全面强直阵挛性的癫痫样异常,而间断缺氧预处理-癫痫组大鼠的背景脑电仅出现偶发性的痫样放电。诱发癫痫的改良Racine评分平均峰值在氯化锂-匹鲁卡品注射后50-150分钟之间,然后逐渐消退。间断缺氧预处理-癫痫组平均改良Racine评分明显低于其余两组。而间断缺氧预处理-抑制剂-癫痫组大鼠的发作表现与癫痫组大鼠基本相似。间断缺氧预处理-癫痫组的全身性发作潜伏期和全身性发作百分比相比其余两组,差异具有统计学意义(P0.05)。免疫印迹分析表明与癫痫组相比,MCT4的表达在间断缺氧预处理-癫痫组及间断缺氧预处理-抑制剂-癫痫组均明显上调(P0.05),而间断缺氧预处理-癫痫组及间断缺氧预处理-抑制剂-癫痫组之间无明显区别(P0.05)。免疫荧光双标表明相比癫痫组,大鼠海马CA1区MCT4的表达在间断缺氧预处理-癫痫组及间断缺氧预处理-CHC-癫痫组上调明显。结论:CHC是乳酸和丙酮酸转运的抑制剂,并不影响MCT4的表达。然而,乳酸转运功能的干扰将阻断IHP预处理所诱导的大鼠癫痫耐受的有效保护作用。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.1

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