Necrostatin-1对脑缺血再灌注损伤后少突胶质前体细胞的保护作用及机制研究

发布时间：2019-12-03 01:07

【摘要】：目的:已有研究表明,程序性坏死抑制剂Necrostatin-1可抑制脑缺血后神经元发生程序性坏死。本课题主要探讨程序性坏死抑制剂Necrostatin-1对脑缺血再灌注损伤后少突胶质前体细胞(OPC)、白质损伤以及小鼠远期神经功能恢复的作用及机制研究。方法:1.体外实验:本课题利用原代小鼠OPC在OGD条件下培养2小时后恢复正常OPC培养基建立体外缺血再灌注损伤模型。分别将程序性坏死抑制剂Necrostatin-1,广谱的凋亡抑制剂Z-VAD-fmk,以及阴性对照组DMSO加入OPC培养基中预处理1小时,然后将其置于缺糖缺氧条件下培养2小时后换成正常OPC培养基。本课题利用碘化吡啶(propidiumiodide,PI)和Calcein-AM(C-AM)共染色检测细胞死亡率、MTT方法检测OGD处理后24小时的细胞存活率,使用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验检测细胞膜通透性间接反映细胞坏死情况,并分别于OGD处理后6小时,12小时以及24小时提取OPC总蛋白。通过Western blot方法检测OPC中受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1),受体相互作用蛋白激酶 3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3),混合系激酶样结构蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)及磷酸化的混合系激酶样结构蛋白(phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein,P-MLKL)的表达水平。2.体内实验:成年雄性ICR小鼠(25-30g)作为实验用动物,使用线栓阻塞小鼠大脑中动脉的方法(MCAO)建立体内脑缺血再灌注损伤模型(缺血60分钟后恢复血流供应24小时)。在MCAO开始前1小时,本课题利用脑立体定位仪进行定位,使用微量进样器分别将Necrostatin-1、DMSO(0.04mg/kg)注射至不同分组小鼠右侧侧脑室中。MCAO术后24小时,将小鼠脱臼处死,从小鼠全脑中取出脑室下区(SVZ)和胼胝体(CC)组织,并加入RIPA蛋白裂解液提取组织总蛋白,通过Western blot方法检测富含OPC的SVZ和CC部位RIPK1,RIPK3,MLKL 及P-MLKL蛋白的表达水平变化情况。本课题通过免疫荧光染色观察小鼠MCAO后SVZ和CC中OPC的幸存情况,并利用LuxolFastBlue(LFB)染色检测脑白质损伤,通过足错误实验和Morris水迷宫实验评估小鼠MCAO后远期神经功能恢复情况。结果:1.体外实验(1)OGD损伤可导致PI标记的OPC数量明显增多(P0.001),与OGD组相比较,Necrostatin-1可显著地减少PI标记的坏死的OPC(P0.001);通过MTT实验检测OGD对OPC存活率的影响,OGD损伤后OPC存活率明显减少(P0.001),与OGD组相比,Necrostatin-1可增加OPC存活率(P0.05);利用LDH实验检测细胞膜通透性间接反映细胞坏死情况,结果发现OGD损伤可促进OPC释放LDH(P0.001),与OGD组相比,Necrostatin-1则能明显抑制LDH的释放(P0.001)。然而,与OGD组相比,广谱的凋亡抑制剂Z-VAD-fmk并没有明显减少PI标记的坏死的OPC、OPC存活率以及OPC释放LDH(P0.05)。(2)OGD后6小时RIPK1蛋白表达水平明显上调(P0.05),RIPK3表达水平则在OGD后12小时显著升高(P0.01)。本课题还进一步发现在OGD后24小时,RIPK3的下游靶蛋白MLKL表达水平也出现了明显的上调(P0.05),且MLKL蛋白升高的主要成分是磷酸化的MLKL(P-MLKL),即程序性坏死的执行蛋白(P0.05)。(3)Necrostatin-1可显著地抑制OGD损伤后OPC中RIPK1蛋白的表达(P0.05)以及RIPK3的表达水平(P0.01),另外,Necrostatin-1还能明显下调OGD后OPC中MLKL和P-MLKL蛋白的表达水平(P0.05)。2.体内实验(1)与sham组相比,小鼠MCAO后24小时,损伤侧SVZ和CC部位RIPK1和RIPK3蛋白水平均显著升高(P0.05)。同时,与sham组相比,小鼠MCAO后损伤侧SVZ和CC部位的MLKL及P-MLKL蛋白表达也明显地上调(P0.05)。(2)与vehicle组损伤侧半球相比,Necrostatin-1显著地抑制了小鼠MCAO后24小时损伤侧SVZ及CC部位RIPK1蛋白的表达(P0.05),并能下调RIPK3蛋白在损伤侧SVZ(P0.05)和CC(P0.01)部位的表达。Necrostatin-1组与vehicle组相比,损伤侧SVZ和CC部位MLKL蛋白的表达水平也明显地下降(P0.05)。本课题还观察到,与vehicle组相比,Necrostatin-1显著地抑制了损伤侧SVZ和CC部位P-MLKL的表达水平(P0.05)。(3)与vehicle组相比,在损伤侧CC部位Necrostatin-1明显地增加了 NG2-阳性的OPC数量(P0.05)。本课题通过LFB染色评估白质损伤情况,结果发现:与vehicle组相比,Necrostatin-1组损伤侧CC部位LFB-阳性的髓鞘密度明显地增加(P0.05)。(4)通过Morris水迷宫和足错误实验测定小鼠行为学改善情况。在Morris水迷宫实验中,Necrostatin-1组小鼠逃避潜伏期明显少于vehicle组(P0.05)。平台被移去后,与vehicle组相比,Necrostatin-1组小鼠穿过目标象限的次数显著地增加(P0.05),并且Necrostatin-1组的小鼠在目标象限停留的时间显著长于vehicle组(P0.01)。在足错误实验中,Necrostatin-1组小鼠左前肢与右前肢足错误的步数的差值明显小于vehicle组(P0.01)。结论:缺血性损伤可以诱导OPC发生程序性坏死,而且是依赖于脑缺血后诱导RIPK1,RIPK3,MLKL以及P-MLKL蛋白表达上调的坏死过程。我们的研究发现:在脑缺血再灌注损伤后程序性坏死的抑制剂Necrostatin-1可通过抑制RIPK1,RIPK3,MLKL及P-MLKL蛋白表达从而促进OPC的幸存并能改善小鼠缺血性脑白质损伤和远期神经功能的恢复。研究结果将为治疗缺血性脑卒中引起的白质损伤提供新的靶点和理论基础。
【图文】：

小鼠,损伤后,表达水平,比值

图２．邋ＯＧＤ损伤诱导原代小鼠ＯＰＣ中ＰＩＰＫ１，邋Ｒ丨ＰＫ３，邋ＭＬＫＬ及ＩＭＶ１ＬＫＬ蛋白的表达上调。原代小逡逑鼠０ＰＣ在缺糖缺氧条件下培养２小时，分别于ＯＧＤ损伤后６小时、１２小时、２４小时向ＯＰＣ培养孔逡逑中加入ＲＩＰＡ蛋白裂解液提取细胞总蛋白。（Ａ）ＲＩＰＫｌ，ＲＩＰＫ３，邋ＭＬＫＬ以及Ｐ－ＭＬＫＬ蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑代表图；（Ｂ）邋ＲＩＰＫ丨与ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｃ）邋ＲＩＰＫ３邋与ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｄ）邋ＭＬＫＬ邋与ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｅ）逡逑Ｐ－ＭＬＫＬ邋与Ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值。Ｂａｒｓ邋代表均数士标准误（ｎ＝６邋每组）。＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１邋ｖｓ邋对照组（Ｃｔｒｌ）。逡逑３．邋Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１可抑制ＯＧＤｔ贝伤后小鼠原代ＯＰＣ中程序性坏死相关蛋白的逡逑表达水平并能减少磷酸化的ＭＬＫＬ表达逡逑Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１显著地抑制了邋０ＧＤ损伤后０ＰＣ中ＲＩＰＫ１蛋白的表达（ｉ＾Ｏ．Ｃ＾Ｆｉｇ．邋３Ａ逡逑和３Ｃ）以及ＲＩＰＫ３的表达水平（Ｐ＜０．０１，Ｆｉｇ．邋３Ｂ和３Ｄ）。该项研宄结果进一步表明逡逑Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１邋可明显下调邋０ＧＤ邋损伤后邋０ＰＣ邋中邋ＭＬＫＬ邋蛋白（Ｐ＜０．０５，Ｆｉｇ．邋３Ｅ邋和邋３Ｆ）和逡逑Ｐ－ＭＬＫＬ蛋白（Ｐ＜０．０５，邋Ｆｉｇ．３Ｅ和３Ｇ）的表达水平。逡逑

损伤后,相关蛋白,表达水平,磷酸

图３．邋Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－ｌ可抑制ＯＧＤ损伤后小鼠原代ＯＰＣ中程序性坏死相关蛋白的表达水平并能减少磷酸逡逑化的ＭＬＫＬ表达。程序性坏死抑制剂或者阴性对照组ＤＭＳＯ加入ＯＰＣ培养基中预处理１小时，然后逡逑置于缺糖缺氧条件下培养２小时后将其换至正常条件下继续培养。（Ａ）ＯＧＤ损伤后６小时ＯＰＣ中Ｒ丨ＰＫＩ逡逑和ｐ－ａｃｔｉｎ蛋白表达水平的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ代表图；（Ｂ）邋ＯＧＤ损伤后１２小时ＯＰＣ中ＲＩＰＫ３和ｐ－ａｃｔｉｎ蛋白逡逑表达水平的邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋代表图；（Ｃ）邋ＲＩＰＫ１邋与邋ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｄ）邋Ｒ１ＰＫ３邋与ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｅ）邋ＯＧＤ逡逑损伤后２４小时ＯＰＣ中ＭＬＫＬ，邋Ｐ－ＭＬＫＬ邋ｆｌｉｐ－ａｃｔｉｎ蛋白表达水平的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ代表图；（Ｆ）邋ＭＬＫＬ逡逑与ｐ－ａｃｔｉｎ的比值；（Ｇ）邋Ｐ－ＭＬＫＬ与ｐ－ａｃｔｉｎ的比值。Ｂａｒｓ代表均数土标准误（ｎ＝６每组）。＃尸＜０．０５，料尸＜０．０１逡逑ｖｓＯＧＤ邋组。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743

【参考文献】