孕酮减轻ATP诱导的SH-SY5Y细胞损伤

发布时间：2020-01-16 20:36

【摘要】：目的:探讨孕酮对抗腺苷三磷酸(ATP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用和机制。方法:取对数生长期的SH-SY5Y细胞按照孕酮或ATP浓度的不同进行分组,CCK-8法检测细胞存活率,YO-PRO-1染色检测细胞膜通透性,Fluo-3染色检测细胞内Ca~(2+)浓度的变化,Western blot法检测嘌呤能P2X_7受体表达的变化。结果:与对照组相比,不同浓度(1、3、5和7 mmol/L)ATP作用2 h,SH-SY5Y细胞存活率显著降低(P0.05),细胞摄入YO-PRO-1的荧光强度明显增加(P0.05),且呈剂量依赖性。浓度为3、10和30 nmol/L的孕酮预孵育30 min可减轻ATP损伤作用,细胞存活率较单纯ATP组明显升高(P0.05或P0.01)。孕酮(30nmol/L)或P2X_7受体拮抗剂KN-62(500 nmol/L)预孵育30 min均可显著抑制ATP诱导的胞内YO-PRO-1的荧光增强(P0.01),而孕酮和KN-62两者之间没有明显差异。正常组细胞内钙离子含量少,ATP组细胞内钙离子荧光强度较对照组明显增高(P0.05),孕酮(30 nmol/L)或KN-62(500 nmol/L)预孵育30 min可明显降低(P0.05)ATP诱导的胞内钙荧光增强,而孕酮和KN-62两者之间的作用无明显差异。ATP组SH-SY5Y细胞P2X_7受体表达较对照组明显增加(P0.05),而孕酮(30 nmol/L)预孵育30 min则可显著降低ATP诱导的P2X_7受体表达(P0.05)。结论:孕酮可抑制ATP诱导的P2X_7受体表达、膜孔形成和胞内Ca~(2+)升高,降低细胞死亡率,明显减轻高浓度ATP对SH-SY5Y细胞的损伤作用。
【图文】：

H-SY5Ycells．Mean±SEM．n=3．＊＊P＜0.01vscontrolgroup;#P＜0.05，##P＜0.01vsATPgroup．图3孕酮对ATP损伤的SH-SY5Y细胞活力的影响4孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞膜孔形成的影响荧光显微镜下观察YO-PＲO-1的结果，与对照组相比，，ATP组胞内YO-PＲO-1荧光信号明显增强，而孕酮+ATP组和KN-62+ATP组荧光信号明显低于ATP组。多功能酶标仪检测结果示，孕酮+ATP组和KN-62+ATP组细胞内荧光强度分别为103.9%和98.23%，均明显低于ATP(5mmol/L)组的120.5%(P＜0.01)，而与对照组无显著差别(P＞0.05)，见图4。5孕酮对细胞内游离钙离子的影响正常细胞内钙离子含量少且稳定。ATP处理组平均荧光值随着ATP作用时间的延长逐渐增高，即Figure4．Theeffectofprogesterone(PＲOG)andKN-62onYO-PＲO-1uptakeinducedbyATPintheSH-SY5Ycells(×400)．Mean±SEM．n=3．＊＊P＜0.01vscontrolgroup;##P＜0.01vsATPgroup．图4孕酮和KN-62对ATP诱导的细胞摄入YO-PＲO-1的影响胞内钙离子逐渐增高。与ATP组相比，孕酮+ATP组和KN-62+ATP组胞内钙离子均明显降低(P＜0.05)，见图5。6孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞P2X7受体表达的影响Westernblot实验结果示，ATP处理后SH-SY5Y细胞P2X7受体蛋白表达明显增加(P＜0.05)，而预先给予孕酮预孵育，P2X7受体蛋白表达水平则明显低于ATP处理组(P＜0.05)，由此看来孕酮能抑制ATP诱导的SH-SY5Y细胞P2X7受体蛋白表达的上调，见图6。讨论至今继发性脑损伤仍缺乏理想的治疗方法和手段，而孕酮作为神经甾体对脑损伤的保护作用已有较多的报道。许多动物模型实验表明，孕酮可延缓神经细胞的坏死、凋亡，促进血脑屏障重建，减少炎症级联反应，减轻脑水肿，促进神经髓鞘合成［7

Figure5．Theeffectofprogesterone(PＲOG)andKN-62onCa2+concentrationsinducedbyATPinSH-SY5Ycells(×400)．Mean±SEM．n=3．＊＊P＜0.01vscontrolgroup;##P＜0.01vsATPgroup．图5孕酮和KN-62对胞外ATP诱导的细胞内Ca2+浓度的影响Figure6．Theeffectofprogesterone(PＲOG)ontheproteinex-pressionofP2X7receptor(P2X7Ｒ)inducedbyATPintheSH-SY5Ycells．Mean±SEM．n=3．＊＊P＜0.01vscontrolgroup;#P＜0.05vsATPgroup．图6孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞P2X7受体表达的影响脑组织ATP主要由神经胶质细胞释放，且具有递质活性，故称为胶质递质。生理情况下胞内ATP达mmol/L浓度，胞外μmol/L水平。胞外μmol/L水平的ATP可激活P2X7Ｒ，形成阳离子通道，介导Ca2+、Na+内流以及K+外流，使细胞去极化，维持神经细胞正常兴奋活动。而在脑外伤、脑缺血、炎症等些病理情况下，受伤局部的胶质细胞释放出大量ATP及其降解产物，且向邻近区域扩散，高浓度ATP长时间或者反复刺激细胞膜上P2X7Ｒ，形成允许各种阳离子和900D以下的有机物质通过的“膜孔”，使细胞内环境稳态失衡而死亡。膜孔形成可加速Ca2+内流，引起钙超载，使胶质细胞释放致炎因子，引发炎症反应，加重脑组织损伤［13］。Suadicani等［14］采用表达P2X7受体的人类胶质细胞瘤1321N1细胞系作为实验对象，发现苯甲酰苯甲酸腺嘌呤核苷三磷酸可使胞内Ca2+浓度、YO-PＲO-1摄取及ATP释放明显增加。有研究表明ATP作用于分化的NG108-15神经细胞，激活P2X7受体后不仅引起细胞内钙超载，而且通过三磷酸肌醇受体介导钙释放，最终导致细胞的凋亡［15］。因此钙超载也是P2X7Ｒ产生毒性作用的重要因素。

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本文编号：2570453