PSMB5对神经干细胞增殖能力的影响
发布时间：2020-01-18 17:26
【摘要】：目的:应用基因沉默技术手段,观察下调PSMB5对NSCs增殖潜能的影响,揭示年龄依赖性NSCs增殖能力降低的机制,以期为神经退行性疾病的治疗提供新思路。方法:1.体外分离培养胚胎(E14)、新生(P0)、幼年(P30)、成年(P90)和老年(P540)小鼠SVZ NSCs,观察其神经球形成周期和神经球形成率。2.分别提取不同年龄阶段(E14、P0、P30、P90、P540)Balb/c小鼠SVZ组织蛋白,通过Western Blot分析其PSMB5蛋白的表达水平差异。3.设计合成PSMB5-si RNA,电穿孔法转染NSCs,电转后48h提取细胞总RNA,72h提取细胞全蛋白,RT-PCR及Western Blot分别从转录水平和蛋白水平测定PSMB5沉默效率,荧光分光光度法检测蛋白酶体活性。4.测量神经球平均直径和数量,并应用Brd U掺入实验分析PSMB5基因沉默对NSCs增殖能力的影响,5.Western Blot检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1及CDK4的表达变化。结果:1.分离培养的不同年龄阶段小鼠NSCs,其中与E14或P0相比,P30、P90及P540小鼠NSCs形成神经球的周期较长,神经球形成率较低,提示NSCs增殖能力呈年龄依赖性下降趋势;同时,Western Blot检测各年龄组SVZ组织蛋白显示PSMB5的表达水平随年龄增高也呈递减趋势,提示PSMB5可能参与NSCs增殖能力的调控。2.Real-time PCR定量分析法和Western Blot半定量分析法分别检测si RNA组和对照组PSMB5 m RNA及PSMB5蛋白的表达变化,结果显示si RNA组PSMB5m RNA和蛋白表达水平较对照组分别降低61.23±1.62%和40.11±2.45%(P0.05),且蛋白酶体活性较对照组降低24.36±0.14%(P0.01),提示PSMB5-si RNA电转染NSCs能够抑制其PSMB5的表达,并下调蛋白酶体活性。3.si RNA组神经球平均直径和数量均较对照组显著降低(P0.05);Brd U掺入实验结果显示si RNA组Brd U阳性率21.58±3.29%较对照组53.47±7.36%显著下降(P0.05),提示PSMB5基因沉默能抑制NSCs增殖能力。4.应用Western Blot半定量分析转染后细胞周期相关蛋白的表达水平,结果显示si RNA组细胞周期依赖性蛋白Cyclin-D1及其激酶CDK4的表达水平分别较对照组下降46.82±3.14%和32.86±2.75%(P0.05),提示PSMB5基因沉默可能通过下调细胞周期依赖性蛋白Cyclin D1及其激酶CDK4的表达水平,从而影响NSCs增殖潜能。结论:1.PSMB5可能参与NSCs增殖潜能的调控。2.PSMB5基因沉默能够通过降低蛋白酶体活性,下调细胞周期依赖性蛋白Cyclin-D1及其激酶CDK4的表达,从而抑制NSCs增殖潜能。
【图文】：
2.1 SVZ NSCs 增殖潜能呈现年龄依赖性下降趋势NSCs 原代初接种培养时细胞呈圆形，体积较小，胞体透明，，折光性强。之后，圆形细胞体积逐渐增大，个别细胞开始分裂呈哑铃形；数天后培养瓶中开始出现一些小神经球，神经球由 5-8 个圆形细胞紧密聚集而成，球体中心部比较膨隆有立体感（图 1-1）。将不同年龄阶段 NSCs 按照 1 ×105/mL 的密度接种于 6 孔培养板，观察不同年龄阶段 NSCs 形成神经球（约 120μm）所需时间(图 1-2)，神经球达到 120μm时 E14 组和 P0 组约需 3-4d，P30 组需要 5-7d，P90 组需要 8-10d，而 P540 组时间比较长需要 12-14d，且形成神经球的数目呈递减趋势(图 1-3)。提示随着年龄增加，NSCs 形成神经球的周期逐渐延长，NSCs 的增殖能力下降，NSCs 的增殖能力随年龄呈递减趋势，表现在神经球形成周期和神经球数目的差异。
2.2 SVZ PSMB5 蛋白的表达水平呈现年龄依赖性下降趋势提取各年龄阶段小鼠 SVZ 组织蛋白，通过 Western Blot 方法检测 PSMB5 蛋白的表达水平，实验结果显示 E14 和 P0 小鼠 SVZ PSMB5 的表达明显高于 P30，P9P540，差异有统计学意义(P<0.05)。P540 小鼠 SVZ PSMB5 的表达显著降低，与其他组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。P30、P90 的表达介于 E14 和 P540 之间且两组相比差异无统计学意义(P>0.05) (图 2-1)，表明 PSMB5 的表达随年龄增高也呈递减趋势，提示 PSMB5 可能参与 NSCs 增殖潜能的调控。5图 1-2 不同年龄阶段 NSCs 形成神经球所需时间（*P<0.05 vs E14）图 1-3 不同年龄阶段 NSCs 形成各直径范神经球数目（*P<0.05 vs E14）20-60μm 60-80μm 80-100μmE14 P0 P30 P90 P540
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
本文编号：2570924
【图文】：
2.1 SVZ NSCs 增殖潜能呈现年龄依赖性下降趋势NSCs 原代初接种培养时细胞呈圆形，体积较小，胞体透明，，折光性强。之后，圆形细胞体积逐渐增大，个别细胞开始分裂呈哑铃形；数天后培养瓶中开始出现一些小神经球，神经球由 5-8 个圆形细胞紧密聚集而成，球体中心部比较膨隆有立体感（图 1-1）。将不同年龄阶段 NSCs 按照 1 ×105/mL 的密度接种于 6 孔培养板，观察不同年龄阶段 NSCs 形成神经球（约 120μm）所需时间(图 1-2)，神经球达到 120μm时 E14 组和 P0 组约需 3-4d，P30 组需要 5-7d，P90 组需要 8-10d，而 P540 组时间比较长需要 12-14d，且形成神经球的数目呈递减趋势(图 1-3)。提示随着年龄增加，NSCs 形成神经球的周期逐渐延长，NSCs 的增殖能力下降，NSCs 的增殖能力随年龄呈递减趋势，表现在神经球形成周期和神经球数目的差异。
2.2 SVZ PSMB5 蛋白的表达水平呈现年龄依赖性下降趋势提取各年龄阶段小鼠 SVZ 组织蛋白，通过 Western Blot 方法检测 PSMB5 蛋白的表达水平，实验结果显示 E14 和 P0 小鼠 SVZ PSMB5 的表达明显高于 P30，P9P540，差异有统计学意义(P<0.05)。P540 小鼠 SVZ PSMB5 的表达显著降低，与其他组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。P30、P90 的表达介于 E14 和 P540 之间且两组相比差异无统计学意义(P>0.05) (图 2-1)，表明 PSMB5 的表达随年龄增高也呈递减趋势，提示 PSMB5 可能参与 NSCs 增殖潜能的调控。5图 1-2 不同年龄阶段 NSCs 形成神经球所需时间（*P<0.05 vs E14）图 1-3 不同年龄阶段 NSCs 形成各直径范神经球数目（*P<0.05 vs E14）20-60μm 60-80μm 80-100μmE14 P0 P30 P90 P540
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【参考文献】
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本文编号：2570924
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