Salubrinal在氯化锂—匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元凋亡中的作用及机制

发布时间：2020-02-28 21:31

【摘要】：癫痫(epilepsy)是一种慢性脑部疾病,它严重危害人类的健康,发病率在神经系统疾病中仅次于脑血管疾病。我国约有900万人受其危害,且约30%被诊断为难治性癫痫。其中,颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)在该类型中最常见,而氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠模型可以很好地模拟研究人类颞叶癫痫。Salubrinal,在国内有许多学者认为其可能是一种有很好的神经保护作用的药物,可以选择性抑制elf2α去磷酸化。在细胞应激状况下,elf2α磷酸化状态可以使细胞的内环境保持相对稳定。此外,elf2α磷酸化可使胞内蛋白合成减少,也可使ATF4的表达增加。目前来说细胞凋亡可能主要有三条信号通路:1、内质网途径;2、线粒体途径以;3、死亡受体途径。Boycott等[1]研究发现,salubrinal是可以有效抑制内质网应激所导致的细胞凋亡,但是具体机制目前还不是很清楚。Parkin,它是E3泛素连接酶,在线粒体自噬和凋亡过程中扮演十分重要的作用[2,3],Parkin的主要功能主要是通过介导底物蛋白泛素化来调控蛋白的降解以及信号通路。研究表明,在许多应激下,Parkin具有保护细胞、抑制细胞死亡的作用[4,5,6]。但是目前为止,Salubrinal在神经元凋亡中的作用还不是很清楚,是否能减轻氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的凋亡也不确定。本课题把氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠模型作为本次研究的对象,把Salubrinal作为该模型的干预剂,观察癫痫发作后海马神经元的凋亡情况,并探究Salubrinal的磷酸化水平及Parkin介导的线粒体自噬水平,最后明确癫痫大鼠海马神经元的凋亡及Salubrinal对凋亡的保护作用,并探讨其机制。本研究分二个部分:第一部分Salubrinal对癫痫大鼠海马神经元凋亡的保护作用及机制研究目的研究癫痫大鼠海马神经元的凋亡及Salubrinal对凋亡的保护作用,并探讨其机制。方法60只成年雄性并且健康的wistar大鼠随机分为对照组、PILO组(氯化锂-匹鲁卡品诱导的大鼠癫痫模型)、Salubrinal(Sal)+PILO组及Sal组。TUNEL和免疫组化观察对照组和处理组癫痫持续状态(SE)后24h海马神经元的凋亡。Western blot实验分析海马elf2α、P-elf2α、Parkin及LC3的表达情况。结果1、PILO组与对照组相比海马神经元存在明显的凋亡。2、较PILO组而言,Sal+PILO组海马神经元凋亡明显减轻。3、Sal+PILO组与PILO组相比,海马神经元P-elf2α表达量增高(P0.05),而elf2α表达无明显变化;LC3II的表达量及Parkin显著增高(P0.05)。结论1、氯化锂-匹鲁卡品诱导的癫痫大鼠存在海马神经元凋亡。2、Salubrinal能够减轻癫痫大鼠海马神经元凋亡,其机制可能是Salubrinal通过elf2α磷酸化上调parkin表达、增加自噬水平,进而有效减少癫痫大鼠海马神经元调亡。第二部分Parkin介导的线粒体自噬对癫痫大鼠海马神经元凋亡的保护作用目的明确Parkin介导的线粒体自噬对癫痫大鼠海马神经元凋亡的保护作用。方法用Parkin过表达重组腺病毒转染大鼠海马CA1区7天后,腹腔注射氯化锂-匹鲁卡品诱导大鼠颞叶癫痫模型。将60只健康雄性wistar大鼠随机分为4组,野生型对照组(Ctr组);匹鲁卡品癫痫组(PI组);匹鲁卡品+Parkin过表达腺病毒组(PIPO组)以及Parkin过表达腺病毒组+生理盐水(PO组)。观察和比较Ctr组和处理组癫痫持续状态(SE)后24h海马CA1区凋亡的变化。Western blot分析和比较各组海马Parkin及LC3的蛋白表达情况。透射电镜下观察和比较各组大鼠海马自噬小体和凋亡小体的数量。结果1、与Ctr组相比,PI组海马CA1区凋亡数量明显增多,而PIPO组海马凋亡数量较PI组明显减少(P0.05)。2、与Ctr组相比,透射电镜下PI组海马神经元线粒体超微结构明显破坏,自噬小体和凋亡小体数量明显增多;与PI组相比,PIPO组海马神经元线粒体超微结构破坏减轻,自噬小体数量明显增加,但凋亡小体数量明显减少。3、Western blot实验分析显示,与Ctr组相比,PI组Parkin表达水平降低,LC3II/LC3I比值升高(P0.05)。与PI组比较,PIPO组Parkin和LC3II/LC3I比值均明显升高(P0.05)结论1、氯化锂-匹鲁卡品诱导的癫痫大鼠海马Parkin表达水平下降,伴随明显的凋亡及线粒体损伤。2、Parkin过表达可减轻癫痫大鼠的凋亡和线粒体损伤,Parkin介导的线粒体自噬对氯化锂-匹鲁卡品癫痫大鼠海马神经元凋亡具有保护作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.1

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