Ac2-26经由分子伴侣自噬降解NCM诱导的小胶质细胞IKKβ蛋白

发布时间：2020-03-19 07:09

【摘要】：Annexin A1(ANXA1)是一类具有抗炎作用的膜联蛋白。经典研究指出ANXA1主要结合细胞膜表面甲酸基肽受体(FPR)发挥作用,而在细胞内是否有着同样的抗炎效应不得而知。本研究以氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)刺激神经元后的上清(NCM)培养小胶质细胞,模拟大脑缺血缺氧内环境。探讨外源性ANXA1模拟肽(AC2-26)在胞浆内抑制小胶质细胞炎症因子TNF-α及上游激酶IKKβ的分子机制。结果:1.AC2-26下调NCM刺激的小胶质细胞TNF-α分泌及表达:ELISA及RT-PCR检测TNFα蛋白分泌及基因表达,结果显示:NCM刺激TNFα蛋白分泌及基因表达增多,AC2-26处理TNF-α蛋白分泌及基因表达均显著降低,FPR受体阻断剂BOC-1对A2-26介导的TNF-α没有影响。自噬抑制剂NH_4CL可以翻转AC2-26的作用。Western blot检测小胶质细胞内TNFα蛋白表达,结果呈示:在NCM和AC2-26刺激下,细胞内TNFα蛋白与对照组比拟无显著性差别。共聚焦免疫荧光检测AC2-26在小胶质细胞分布,结果显示:外源性FITC-AC2-26主要分布在小胶质细胞胞浆内。2.AC2-26通过自噬降低小胶质细胞IKKβ蛋白活性:Western blot检测IKKβ及其下游p-IκB蛋白,结果显示:NCM处理小胶质细胞,与对照组相比,IKKβ及其下游p-IκB蛋白表达显著增加。外源性给予AC2-26刺激24小时,可以翻转NCM作用。RT-PCR检测IKKβ基因表达,结果显示:NCM处理后IKKβ基因表达增加,而加入AC2-26,与NCM组相比无显著性差异。在AC2-26基础上加入NH_4CL预处理半小时,与AC2-26组相比,IKKβ蛋白表达增多而mRNA没有显著变化。CO-IP检测ANXA1与IKKβ结合,结果显示:ANXA1与内源性IKKβ没有相互作用。3.AC2-26促进小胶质细胞HSPB1高表达:Western blot检测小胶质细胞HSPB1表达,结果显示:AC2-26单独处理或与NCM共刺激小胶质细胞24小时,HSPB1蛋白表达均增加。CO-IP检测ANXA1与HSPB1相互作用,结果显示:ANXA1可与内源性HSPB1结合。4.HSPB1负性调节IKKβ蛋白表达:CO-IP检测HSPB1与IKKβ结合,结果显示:NCM处理原代小胶质细胞,与对照组比拟,内源性HSPB1与IKKβ结合增加。预处理AC2-26,结合作用进一步增强。Western blot检测HSPB1与IKKβ相互关系,结果显示:与单独转染Flag-IKKβ相比,同时表达Flag-IKKβ及GFP-HSPB1,IKKβ蛋白显著减少。干扰HSPB1 48小时后IKKβ蛋白表达增加,相应下游TNFα蛋白分泌增加。并且,干扰HSPB1可翻转AC2-26对IKKβ蛋白的抑制作用。5.AC2-26激活小胶质细胞分子伴侣自噬:Western blot检测自噬标记物表达,结果显示:AC2-26处理原代小胶质细胞24小时后,与对照组相比,巨自噬标记物LC3-II及其底物P62没有显著变化;分子伴侣自噬标记物LAMP-2A表达增加,相应底物GADPH显著减少。与NCM处理组相比,LC3-II没有变化,LAMP-2A表达增加。共聚焦免疫荧光检测LAMP-2A在溶酶体表达,结果显示:AC2-26处理后原代小胶质细胞LAMP-2A与LAMP-1共定位显著增加。6.ANXA1与HSBP1共同协助IKKβ转运至溶酶体:蛋白氨基酸序列分析ANXA1,HSBP1和IKKβ三种蛋白KFERQ序列,结果显示:IKKβ、AC2-26及HSPB1蛋白均含有有KFERQ类似肽段。CO-IP检测HSC70与三种蛋白结合,结果显示:ANXA1及HSPB1均可与HSC70结合,IKKβ未检测到沉淀。CO-IP检测LAMP-2A与三种蛋白结合,结果显示:三种蛋白都可与LAMP-2A结合;降低HSC70表达,结合减少。降低ANXA1表达,IKKβ与LAMP-2A结合减少;降低HSPB1表达,IKKβ与LAMP-2A结合也减少。7.IKKβ通过分子伴侣的自噬降解:提取大鼠脑组织溶酶体,Western blot检测IKKβ、ANXA1及HSPB1蛋白在溶酶体表达,结果显示:IKKβ、ANXA1及HSPB1均在溶酶体内表达;与对照组相比,AC2-26处理后溶酶体内IKKβ、ANXA1及HSPB1蛋白表达显著增加。ELISA及Western blot检测分子伴侣的自噬对IKKβ溶酶体降解作用,结果显示:干扰原代小胶质细胞LAMP-2A表达,TNFα蛋白分泌显著增加,IKKβ蛋白表达增加;并且干扰LAMP-2A可翻转AC2-26对IKKβ蛋白的抑制作用。RT-PCR检测HSPB1或LAMP-2A对IKKβ基因表达影响,结果显示:无论在正常或NCM刺激条件下,干扰小胶质细胞内HSPB1或LAMP-2A,IKKβ的mRNA水平均无变化。结论:外源性AC2-26与胞浆HSPB1结合,通过促进HSPB1与IKKβ相互作用,并结合到LAMP-2A,由分子伴侣的自噬降解小胶质细胞IKKβ,从而抑制下游TNFα表达。
【图文】：

自噬,折叠结构,溶酶体,步骤

62图 1. 自噬的分类及大致步骤结合，打开折叠结构直接进入溶酶体降解。本篇综述主要探讨分子伴侣介导的自噬在中枢神经系统的作用。发现历程在二十世纪八十年代早期,普遍认为自噬是一种非选择性的大量吞噬过程,但有研究观察到胞浆蛋白在溶酶体中降解速率各不相同[4]。在培养的成纤维细胞中，移除培养基中的营养成分可以加速某些蛋白的降解，而不影响其他蛋白降解速率[5]。于是有

分子伴侣,底物,复合物,模体

64图 2. CMA 降解步骤：(a)hsc70 分子伴侣复合物识别底物蛋白；(b)底物-分子伴侣复合物结合LAMP-2A；(c)底物蛋白打开折叠结构；(d)LAMP-2A 聚合，底物转运及降解；(e)LAMP-2A 解聚特异性的模体被分子伴侣识别发挥下游作用，然而在某些蛋白质中，模体埋藏在蛋白结构中心，，需要分子伴侣协助打开蛋白折叠；或者模体隐藏在蛋白质相互结合的区域，底物必须从蛋白复合物中解离才能被分子伴侣识别；又或者模体在蛋白质与膜结合的区域，底物蛋白从亚细胞膜上释放才能与分子伴侣结合。事实上，CMA 底物蛋白模体与氨基酸电荷属性有关，一个残缺的包含四个氨基酸的模体通过翻译后修饰如磷酸化、乙酰化等可以创造出新的模体结构，改变氨基酸电荷属性形成 CMA 底物
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3

【参考文献】