HAX-1蛋白通过Akt1通路对胶质瘤细胞增殖和调亡的影响及机制研究

发布时间：2020-03-20 02:05

【摘要】：背景与目的:胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,同时仍是神经系统疾病中的治疗难点之一,尤其是恶心程度高的高级别胶质瘤,患者生存率仍处于较低的水平。因此,在细胞、分子水平深入探索胶质瘤发病、转归等方面的机制,以此探寻胶质瘤的治疗靶点,为胶质瘤提供新的治疗方式,显得尤为迫切。造血干细胞特异蛋白1-相关蛋白X-1(HAX-1)是近年来被发现的一种抗凋亡蛋白,在多种肿瘤细胞中呈过表达状态,并促进肿瘤细胞的增殖、迁移并抑制肿瘤细胞凋亡。HAX-1蛋白具有多种生物学功能,但在胶质瘤中的研究仍处于空白,本次研究中将以HAX-1为切入点,研究HAX-1胶质瘤增殖和凋亡中的作用,并初步探讨HAX-1的作用机制。方法:1.细胞培养:培养人神经胶质瘤细胞U118,U87-MG,U251和SHG44,人神经胶质细胞HA。2.免疫组化染色:明确人神经胶质瘤组织中HAX-1的表达情况。3.qPCR技术:检测神经胶质细胞和神经胶质瘤细胞中HAX-1的转录水平变化,神经胶质瘤组织与瘤旁组织中HAX-1转录水平的变化;神经胶质瘤细胞U118和U87-MG中p53蛋白转录水平的变化。4.Western blot蛋白免疫印迹技术:检测人胶质瘤组织和瘤旁组织中HAX-1的表达情况;人胶质瘤细胞和人神经胶质细胞中HAX-1的表达情况;胶质瘤细胞U118和U87-MG在HAX-1敲除后的检测;胶质瘤细胞U118和U87-MG中p21、BAX、p53和Hsp90蛋白的表达情况;胶质瘤细胞U118和U87-MG在氧化应激条件下Caspase9、Caspase3和PARP蛋白激活的情况;胶质瘤细胞U118和U87-MG中p53蛋白的降解速度和泛素化水平;胶质瘤细胞U118和U87-MG中Akt1和MDM-2蛋白的磷酸化水平变化;胶质瘤细胞U118和U87-MG中Akt1与Hsp90相互作用的变化。5.克隆形成试验:检测HAX-1敲除前后克隆形成能力的变化。6.Edu细胞增殖实验:利用Edu标记增殖期细胞以评价在HAX-1敲除前后胶质瘤细胞增殖能力的变化。7.流式细胞周期测定:利用流式细胞仪检测HAX-1敲除前后胶质瘤细胞U118和U87-MG细胞周期的变化。8.流式细胞凋亡测定:利用流式细胞仪检测HAX-1敲除前后胶质瘤细胞U118和U87-MG在氧化应激条件下凋亡情况的变化。9.免疫共沉淀:利用免疫共沉淀技术检测胶质瘤细胞U118和U87-MG中HAX-1与Hsp90蛋白的结合,HAX-1敲除前后胶质瘤细胞U118和U87-MG中p53蛋白泛素化水平的变化,Akt1与Hsp90蛋白间相互作用的变化。10.免疫荧光共定位染色:利用免疫荧光共定位染色检测在胶质瘤细胞U118和U87-MG中Hsp90,HAX-1和Akt1蛋白在细胞内分布以及共定位情况的变化。结果:通过一系列的实验以及相关结果的统计分析,我们发现HAX-1蛋白在胶质瘤组织和细胞中呈现高表达状态,而且HAX-1的表达与肿瘤体积、分化程度和病理学分级相关,是胶质瘤的独立预后因素。我们在胶质瘤细胞U118和U87-MG中调控HAX-1表达后发现,HAX-1蛋白敲除后能够抑制胶质瘤细胞U118和U87-MG克隆形成能力,降低增殖期细胞比例,使U118和U87-MG细胞阻滞于G0/G1期,且导致周期蛋白p21的表达升高。HAX-1蛋白敲除后同样能够使胶质瘤细胞U118和U87-MG在过氧化氢模拟氧化应激环境下凋亡率升高,Caspase9、Caspase3和PARP等凋亡蛋白激活水平升高。相应的,HAX-1敲除后p53蛋白及下游蛋白BAX等凋亡相关蛋白的表达升高。进一步的分析发现,HAX-1蛋白并不影响胶质瘤细胞U118和U87-MG中p53蛋白的转录,而是通过影响p53蛋白的泛素化而促进p53蛋白的降解。同时发现在胶质瘤细胞U118和U87-MG中HAX-1蛋白敲除后p53蛋白的泛素化E3连接酶MDM-2磷酸化水平降低,MDM-2上游蛋白Akt1的磷酸化水平也呈降低趋势,而过表达HAX-1蛋白后,MDM-2和Akt1的磷酸化水平相应升高。继而我们验证了在胶质瘤细胞U118和U87-MG中HAX-1能够与Hsp90结合,并发现HAX-1可以通过与Hsp90蛋白的结合促进Hsp90与Akt1蛋白的结合,通过这种方式促进Akt1蛋白的磷酸化水平。使用Hsp90蛋白选择性抑制剂后,HAX-1蛋白对Akt1、MDM-2蛋白磷酸化水平的促进作用减弱。结论:综上所述,经过本课题的研究我们发现,HAX-1蛋白导致胶质瘤细胞增殖能力和抗凋亡能力增强。
【图文】：

图１．３．１注：ＨＡＸ－１在胶质瘤组织中的表达：Ａ和Ｂ．胶质瘤组织及瘤旁组织病理切片逡逑免疫组织化学染色：使用小鼠ＨＡＸ－１单克隆抗体标记ＨＡＸ－１蛋白，ＨＲＰ标记羊抗鼠多克逡逑隆抗体进行免疫组织化学染色，阳性反应呈橙黄色染色，阴性对照以及瘤旁组织使用苏木逡逑素进行细胞核复燃，分别于２００倍及４００倍下拍摄染色后组织切片状态。如图所示，阴性逡逑对照组和瘤旁组织染色未见明显阳性反应，胶质瘤组织中可见大量阳性反应染色。通过逡逑Ｉｍａｇｅ邋ｐｒｏ邋ｐｌｕｓ软件对图片染色情况进行分析后统计各组图片阳性情况，结果如Ｂ所示。Ｃ．逡逑组织标本荧光定量ＰＣＲ：提取肿瘤组织和瘤旁组织ｍＲＮＡ后进行逆转录ＰＣＲ合成相应的逡逑ｃＤＮＡ文库，并通过ＨＡＸ－１特异性引物进行荧光定量ＰＣＲ邋（ｑＰＣＲ）检测ＨＡＸ－】转录情况，逡逑结果如图所示：肿瘤组织中ＨＡＸ－１的转录明显高于瘤旁组织。Ｄ．组织标本Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋逡逑白免疫印迹检测：提取肿瘤组织和瘤旁组织总蛋白后，通过Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白免疫印迹技术逡逑检测肿瘤组织和瘤旁组织中ＨＡＸ－１蛋白，结果如图所示，肿瘤组织中ＨＡＸ－］蛋白的表达逡逑水平明显高于瘤旁组织。Ｎ即Ｎｏｎｃａｎｃｅｒｏｕｓ，瘤旁组织；Ｔ即Ｔｕｍｏｒ，肿瘤组织。＊＊／■＜０．０１，，逡逑＊＊＊＊？＜邋０．０００１逡逑１４逡逑

图２．３．２注：ＨＡＸ－１敲除后导致胶质瘤细胞周期阻滞：Ａ．流式细胞技术分析细胞周期：逡逑采用ＣＲ丨ＳＰＲ／Ｃａｓ９技术在胶质瘤细胞Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ中敲除ＨＡＸ－丨基因后，通过ＰＩ染逡逑色并采用流式细胞技术，检测ＨＡＸ－１敲除前后胶质瘤细胞的细胞周期分布情况。结果如图逡逑所示，ＨＡＸ－丨敲除后胶质瘤细胞Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ阻滞于Ｇ０／Ｇ丨期。Ｂ．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白免逡逑疫印迹技术检测ｐ２１蛋白的表达：采用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术在胶质瘤细胞Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ逡逑中敲除ＨＡＸ－１基因后，提取ＨＡＸ－１敲除前后的Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ细胞总蛋白，并通过Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ蛋白免疫印迹技术检测器中ｐ２１蛋白的表达情况。以ＧＡＰＤＨ蛋白作为内参蛋白，反应逡逑总蛋白量。结果如图所示，ＨＡＸ－１敲除后，ｐ２１蛋白在Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ细胞中表达量升高。逡逑＊尸邋＜０．０５，邋＊＊＊＊／■邋＜０．０００１逡逑３１逡逑
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

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本文编号：2591073