白细胞介素-10改善脑出血后血脑屏障通透性的分子机制

发布时间：2020-03-23 04:05

【摘要】：背景脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)具有高死亡率和致残率的特点,约占所有中风的10-15%。越来越多的证据表明,ICH后免疫细胞的激活和促炎细胞因子的释放,会引发过度的神经炎症反应,导致血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏和神经细胞死亡,BBB的破坏继而又进一步加剧炎症反应。因此,抑制脑部炎症和维持BBB的完整性是ICH治疗的关键策略。白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)主要由外周的单核细胞和脑部的小胶质细胞/巨噬细胞(microglia/macrophages,MMΦ)分泌,是一种重要的抗炎细胞因子,在炎症反应中发挥重要的免疫调节功能。研究表明在中枢神经系统疾病(Central nervous system,CNS)中,IL-10在大脑中的表达上调会触发多种信号传导途径抑制炎症反应,进而达到保护神经元和胶质细胞的作用。另有研究报道,IL-10对血管内皮具有显著的保护功能。然而,ICH后IL-10是否对BBB产生保护作用尚未见报道。BBB是外周循环和CNS之间的动态结构,由内皮细胞及其间的紧密连接、基膜、周细胞和星形胶质细胞终足组成。BBB保护大脑免受外周血液循环中有毒物质和病原体的侵害,并将营养物质输送到大脑,维持神经系统微环境的稳态。在ICH患者中,BBB通常在发病初始和晚期破坏,渗透性增加,加重病情;另一方面BBB的相对不可渗透性限制了许多有益药物在相关治疗浓度下到达中枢系统,这使得BBB成为治疗出血性中风的主要障碍之一。因此ICH后,在分子和细胞水平上研究BBB相关功能障碍的潜在机制显得尤为重要。为研究ICH后BBB的治疗靶点,建立合适的ICH动物模型显得尤为重要。常用的ICH动物模型有自体血注入法(Blood intracerebral hemorrhage model,b-ICH)、胶原酶注入法(Collagenase intracerebral hemorrhage model,c-ICH)、微球囊充胀法和自发性ICH法。目前国内外最广泛使用的是c-ICH和b-ICH模型。前者则是用胶原酶消化小血管的细胞外基质,剂量依赖性地导致血液外渗;b-ICH则是采小鼠尾动脉血原位注射到脑部核团。但基础研究中,研究者常偏向于使用一种ICH模型,若选择的模型不恰当,未能真正的将研究目的与人类中风的病理生理学特点相结合,会阻碍研究进展,因此开展实验前选择适合与ICH后BBB破坏过程相似的动物模型十分必要。ICH模型的稳定性,与病人BBB的动态变化接近程度直接关系到ICH研究的科学性和实用性。目前,尚无研究在c-ICH和b-ICH两种动物模型中进行BBB破坏特点的比较。因此,本实验首先比较ICH后不同时间点c-ICH和b-ICH两种模型BBB渗透性,紧密连接相关蛋白,水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)及破坏介质基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinases 9,MMP9)等的变化情况;本实验的第二部分主要验证ICH后,IL-10是否对BBB产生保护作用,并进一步探讨其分子机制。本研究旨在解析ICH后BBB破坏的分子机制,证实IL-10的疗效,为研究临床上ICH病人的用药时间窗和药物的治疗靶点提供参考价值。目的(1)通过建立两种c-ICH和b-ICH动物模型,评价BBB损伤的动态变化,为模拟ICH病人提供可靠的动物模型。(2)研究IL-10对ICH后BBB的调节功能和分子机制,为临床ICH后BBB损伤提供潜在的治疗靶点。方法(1)分别建立c-ICH和b-ICH动物模型,评价术后运动功能。将小鼠分为sham组、c-ICH组和b-ICH组。通过优化剂量比较两组模型血肿大小,筛选出两种模型血肿大小一致时所使用的胶原酶浓度和自体血体积。c-ICH组小鼠采用VII型胶原酶(0.05U)立体定位仪注射到小鼠左脑尾状核,定位坐标为前囟前0.6mm,中线左侧旁开2.1mm,距颅骨表面深度3.1mm;b-ICH组小鼠采用自体尾动脉血20μL原位注射到小鼠左脑尾状核。模型建立稳定后,比较三组小鼠术后6h,12h,D1,D3和D5神经行为学变化包括神经功能评分、前肢放置和转角实验。(2)评价c-ICH和b-ICH组ICH后BBB破坏特点,筛选与ICH病人BBB破坏程度接近的出血模型。ICH后6h,12h,D1,D3和D5,采用中分子染料伊文思蓝(Evans blue,EB)和大分子免疫球蛋白IgG(160 Da)示踪渗漏观察sham、c-ICH和b-ICH三组小鼠在术后BBB组分的动态变化,比较c-ICH和b-ICH各自BBB破坏最严重的时间点;采用免疫印迹(Western blot,WB)和透射电镜技术比较c-ICH和b-ICH紧密连接的完整性;明胶酶谱实验比较两种ICH模型术后MMP9的活性;qPCR技术检测sham、c-ICH和b-ICH三组小鼠APQ4的动态表达。(3)论证鼻饲IL-10是否对ICH后小鼠神经功能和BBB具有保护作用。ICH手术后2h鼻饲IL-10(浓度:0.02ug/μL,0.1μg/mouse in 5μL PBS),一天两次,直至D3取材。将实验动物分为三组:sham组,ICH+PBS组和ICH+IL-10组。术后D3,观察小鼠运动功能改变,包括神经功能评分和转角实验等。采用evans blue,WB实验评价BBB渗透性,紧密连接蛋白occludin和cadherin-10的表达。(4)验证IL-10是否可减少胶质细胞表达和促炎因子释放。术后D3,采用免疫荧光分析鼻饲IL-10后血肿周围小胶质细胞和星形细胞的激活,通过荧光计数统计分析胶质细胞激活情况。通过ELISA检测脑组织中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达。研究结果(1)ICH后6h,b-ICH组神经功能缺损评分(NDS)高于c-ICH组,神经运动功能损伤明显,与c-ICH组显著差异(P0.05),其他时间点两组模型运动功能没有差异。(2)术后6h,两组模型血肿周围均有EB渗漏,但c-ICH组在D3血肿周围中EB和IgG渗漏最多,且脑水含量显著高于b-ICH组(P0.05),b-ICH组则在D5渗漏达到峰值(P0.05)。(3)c-ICH组紧密连接蛋白occludin和cadherin-10的表达量在D3,b-ICH组在D5时明显下调(P0.05);透射电镜结果提示术后D3,c-ICH紧密连接变短,破坏严重,b-ICH组紧密连接D5破坏更严重,D3和D5两组模型紧密连接破坏程度具有统计学差异(P0.05);c-ICH组和b-ICH脑组织MMP9活性在术后6h开始升高,但两组在分别在D3和D5活性最高(P0.05);两组模型脑组织的AQP4 mRNA表达量分别在术后D3和D5最高(P0.05)。(4)在c-ICH模型术后D3,IL-10治疗能够明显改善ICH血肿大小和神经功能缺损(P0.05),降低BBB渗透(P0.05),上调紧密连接蛋白cadherin-10和occludin表达(P0.05)。(5)在c-ICH模型术后D3,IL-10可抑制血肿周围小胶质细胞和星形胶质细胞激活(P0.05)和促炎因子TNF-α释放(P0.05)。研究结论(1)c-ICH和b-ICH后BBB损伤最严重的时间点分别发生在ICH术后D3和D5;结合临床ICH病人D1-D3脑水肿增高并达到峰值随后缓慢降低的发病特征,提示c-ICH模型更适合作为研究临床ICH病人脑水肿的预后的基础模型。(2)本研究表明IL-10可抑制血肿周围胶质细胞的激活和炎症因子TNF-α的表达,上调cadherin-10和occludin蛋白,保护c-ICH模型中BBB的完整性。
【图文】：

脑图谱,组模型,体积比,小鼠

没有延伸到其他核区域（图 1.1A）。LFB/CV 染色结果表明 c-ICH 和 b-ICH两组模型血肿体积大小基本一致，但前者血肿比较弥散，而后者则比较集中（图1.1B）。血肿体积结果显示两组没有统计学意义（4.664 ± 2.947 mm3vs 4.580 ±2.826 mm3；n = 8; P > 0.05;图 1.1C）。

死亡率,模型,神经功能缺损评分,体重比

图 1.2 ICH 后 6h，12h，D1，D3 和 D5，c-ICH 和 b-ICH 模型运动功能的比较（A）Sham组，c-ICH 组和 b-ICH 组死亡率。（B）术后 D1，D3 和 D5，三组模型体重比较（n=12; *P <0.05，**P < 0.01 vs. sham group；repeated measuresANOVAfollowed by Bonferroni post hoc test）。（C）神经功能缺损评分（n=12；*P < 0.05 vs. sham group，#P < 0.05 vs. c-ICH group；repeatedmeasuresANOVAfollowed by Bonferroni post hoc test）。（D）转角实验（n=12; *P <0.05 vs.sham group）。（E）前肢放置实验（n=12; *P < 0.05 vs. sham group，repeated measuresANOVAfollowed by Bonferroni post hoc test）。1.4.3 c-ICH 和 b-ICH 模型 BBB 渗漏情况比较EB 染料可立即与血清中的白蛋白（67 kd）结合，因此被用来测量 BBB 的完整性。结果显示 c-ICH 和 b-ICH 均在术后 6h 开始出现 BBB 渗漏，c-ICH 在D3 时 EB 渗漏严重，而 b-ICH D5 EB 渗漏广泛（图 1.3A。c-ICH 和 b-ICH 两组模型在术后 6h 时脑组织中 EB 浓度均开始升高，，但前者在 D3 达到最高，显著高于后者（1.783 ± 0.392 vs 1.472 ± 0.149; P < 0.05; n = 4），而 b-ICH 组在 D5 最为严重显著高于 c-ICH 组（1.879 ± 0.185 vs 1.216 ± 0.216; P < 0.05; n = 4；图1.3B）。术后 D3，c-ICH 组脑水肿含量显著高于严重于 b-ICH 组（82.012 ± 2.077
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.34

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