T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子3对脑出血后炎症反应的实验和临床研究

发布时间：2020-03-23 03:49

【摘要】：研究背景自发性脑出血(Spontaneous Intracerebralhemorrhage,ICH)是常见的脑血管疾病,占全部脑卒中的15-200%,每年全球发病人数超过2百万。在发病6个月内,脑出血的死亡率超过40%,而仅有20%的患者能够独立生活。但是目前临床对脑出血缺乏有效的治疗措施,这主要是因为对脑出血后继发脑损伤的机制还不了解。越来越多的研究示炎症反应在脑出血后继发性脑损伤中起重要作用。炎症反应是以炎性细胞和炎性介质在出血部位大脑中的聚集和激活为特征的。炎症细胞包括血液来源的粒细胞和巨噬细胞,以及脑固有的小胶质细胞、星性细胞和肥大细胞。这些细胞的激活释放一系列炎性介质,包括细胞因子、化学因子、蛋白激酶、前列腺素和其他的炎性活性物质。在所有的炎症细胞中,小胶质细胞是第一个对脑损伤作出反应的细胞。激活的小胶质细胞同血液来源的巨噬细胞形态相似,无法分辨,因此也被称为脑内的巨噬细胞。研究证实小胶质细胞/巨噬细胞在脑出血早期就被激活,并且释放一系列的毒性分子,包括细胞因子、化学因子、活性氧簇,环氧化酶-2、蛋白酶、血红素加氧酶-1和前列腺素,因此,小胶质细胞/巨噬细胞在脑出血后继发性脑损伤中起重要作用。T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain3,Tim-3)是2002发现的新型免疫调节分子,特异性的表达在激活的辅助T淋巴细胞-1。研究证实Tim-3也在固有免疫细胞上表达,包括巨噬细胞、肥大细胞和树突状细胞。Tim-3在小胶质细胞/巨噬细胞上过度表达,诱导前炎症细胞因子的产生,如肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),能够加重炎症反应,诱发继发性脑损伤。但是到目前血后脑组织的炎症反应尚不清楚。因为小胶质细胞/巨噬细胞是诱发脑炎症反应和继发性脑损伤的关键细胞,并且Tim-3可以调节小胶质细胞/巨噬细胞的功能,我们推测Tim-3可能通过调节小胶质细胞/巨噬细胞功能参入脑出血后的炎症反应。这项研究为了证实此假设。第一部分:Tim-3对脑出血后血肿周围脑组织炎症反应的实验研究目的:检测Tim-3在血肿周围脑组织中的表达和细胞来源,探讨Tim-3在脑出血后脑组织炎症反应中的作用。方法:用自体血注射法建立野生型(wild type,WT)小鼠和Tim-3基因敲除(Tim-3-/-)小鼠的脑出血模型,分别在操作后12小时和1、3、5、7天测定血肿周围脑组织中Tim-3的表达、TNF-a和IL-1β的浓度和脑含水量。免疫荧光染色测定Tim-3阳性细胞、星形细胞、中性粒细胞和小胶质细胞/巨噬细胞的数量。免疫荧光双染分辨Tim-3表达的细胞来源。ELISA法测定TNF-a和IL-1β的表达。小鼠行为学测定评估神经缺陷的程度。结果:1.Tim-3阳性细胞数和Tim-3 mRNA在WT脑出血组从出血后12小时开始升高,1天时达高峰,3天时开始下降,与WT对照组比较,Tim-3阳性细胞数和Tim-3mRNA在各检测时间点均有显著性差异(P0.01)。2.免疫荧光双染技术显示Tim-3优势表达在CD11b阳性细胞(小胶质细胞/巨噬细胞),较少在MPO阳性细胞(中性粒细胞)中表达,在GFAP阳性细胞(星形细胞)中表达最少。3.IL-1β和TNF-a的浓度在出血后12小时开始升高,1天时达高峰,3天时开始下降,WT脑出血组与WT对照组比较有显著性差异(P0.01)。血肿周围脑组织含水量在出血后12小时升高,高峰在1天和3天,然后逐渐下降,WT脑出血组与WT对照组比较有显著性差异(P0.01)。4.Tim-3的表达与IL-1β、TNF-a的浓度和脑含水量正相关(IL-1β::0.618,P0.001;TNF-a:r=0.610,P0.001;脑含水量:r=0.566,P=0.001)。5.在Tim-3-/-脑出血组小鼠血肿周围脑组织中IL-1β、TNF-a的浓度显著下降,同WT脑出血组比较有显著性差异(Tim-3-/-脑出血组与WT脑出血组比较,IL-1 β : 12 h P0.01;1d P0.05;3 d P0.05;5d P0.05;7d P0.01.TNF-a12h P0.05;Id P0.05;3d P0.01;5d P0.01;7d P0.01)。在各检测时间点,脑含水量在Tim-3-/-脑出血组也明显降低(Tim-3-/-ICH组与WT出血组比较,12hP0.01;1dP0.01;3d P0.01;5d P0.01;7d P0.05)。出血后12小时和1天,神经功能缺损评分(neurological deficit scores,NDS在TiM3-/-脑出血组与WT脑出血组比较无差异。在出血后3天时,NDS在Tim-3-/-脑出血组与WT脑出血组比较有降低,但两者比较无统计学差异。在出血5天和7天时,NDS在Tim-3-/-脑出血组与WT脑出血组比较明显降低,两者比较有显著性差异(P0.05)。6.脑出血后血肿周围脑组织中星形细胞、中性粒细胞和小胶质细胞/巨噬细胞的数量均升高,但是高峰出现的时间不同。星形细胞在出血1天时增多,在5天和7天时达高峰。中性粒细胞在12小时增多,高峰在3天,然后逐渐降低。中性粒细胞和星形细胞的数量在Tim-3-/-脑出血组和WT脑出血组之间无差异。小胶质细胞/巨噬细胞数量在出血后12小时升高,在1天时达高峰,同Tim-3、IL-1β和TNF-a的变化趋势相同。Tim-3-/-脑出血组小胶质细胞/巨噬细胞数量同WT脑出血组比较显著降低,两组之间有显著性差异(0.01)。结论:Tim-3在脑出血后炎症反应中起重要作用,可能是一种潜在的治疗方法。第二部分:Tim-3在脑出血病人全身炎症反应中的作用目的:研究Tim-3在脑出血病人外周血免疫细胞中的表达及其与脑出血后全身性炎症反应和脑损伤的关系。方法:60例新发病的基底节脑出血的病人和30例健康者纳入该研究。根据发病12小时的脑出血量,将脑出血病人分为小量脑出血组(出血量30ml,30例)和大量脑出血组(出血量30ml,30例)。流式细胞学技术检测Tim-3在外周血免疫细胞中的表达。实时定量逆转录聚合酶链反应测定Tim-3 mRNA在外周血单个核细胞中的表达。出血后1、3和7天的血清白细胞介素-1β,肿瘤坏死因子-a和S-100B蛋白的浓度使用ELISA方法测定。30天的格拉斯哥预后评分(Glasgow outcome scale,GOS)用于评估脑出血病人的恢复情况。结果:1.脑出血后白细胞计数、中性粒细胞计数和单核细胞计数都明显升高,3天时达高峰,7天时下降。但是白细胞计数和中性粒细胞计数在大量脑出血组升高的更加明显,在各个检测时间同小量脑出血组比较均有显著性差异(P0.01)。大量脑出血组的单核细胞计数在3天和7天时显著升高,同小量脑出血组比较差异显著(P0.01)。脑出血后中性粒细胞的比例也有升高,但只在第3天时两个脑出血组之间有差异(P0.01)。至于单核细胞比例,在两个脑出血组之间没有差异。淋巴细胞的变化趋势同中性粒细胞和单核细胞细胞相反,淋巴细胞的计数和比例在各个检测时间点都降低,而在大量脑出血组降低地更加明显,同小量脑出血组比较有显著性差异(p0.01)。2.Tim-3在大量脑出血组病人的CD14+细胞中的表达明显升高,与对照组比较有显著性差异(T=4.174,P0.001)。Tim-3在大量脑出血病人的CD4+T淋巴细胞上的表达轻度升高,同对照组比较无差异(t=1.674,P=0.10)。Tim-3在大量脑出血病人的CD8+T淋巴细胞上的表达明显降低,同对照组比较有显著性差异(t=3.801,P0.001)。3.脑出血后1天,Tim-3 mRNA表达升高,3天时达高峰,7天时下降。在各检测时间点同对照组比较有显著性差异(P0.01)。但是Tim-3 mRNA的表达在大量脑出血病人中升高的更加明显,同小量脑出血组比较有显著性差异(P0.01)。4.在各检测时间点脑出血病人的血清IL-1β和TNF-a浓度都明显升高,同对照组比较有显著性差异(P0.01);但在大量脑出血组升高的更加明显,同小量脑出血组比较有显著性差异(P0.01)。脑出血后7天内血清S-100B蛋白的浓度持续升高,同样,在大量脑出血组升高的更加明显,同小量脑出血组和对照组比较有显著性差异(P0.01)。5.Tim-3的表达与血清IL-1β、TNF-a、S-100B蛋白的浓度之间存在密切正性相关。(IL-1β:小量脑出血组r=0.498,P0.001;大量脑出血组r=0.511,P0.001。TNF-a:小量脑出血组r=0.59,P0.001;大量脑出血组r=0.682,P0.001。S-100B蛋白:小量脑出血组r=0.508,P0.001;大量脑出血组r=0.477,P0.001)GOS评分与Tim-3 mRNA、IL-1β、TNF-a、S-100B蛋白之间存在明显的负性相关。(Tim-3 mRNA:小量脑出血组r=0.650,P0.001;大量脑出血组r=0.723,P0.001。IL-1β:小量脑出血组r=0.492,P=0.06;大量脑出血组r=0.497,P=0.005。TNF-a:小量脑出血组r=0.569,P).001;大量脑出血组r=0.637,P0.001。S-100B蛋白:小量脑出血组r=0.508,P=0.004;大量脑出血组r=0.538,P=0.0、02)。结论:Tim-3在CD14+单核细胞上的表达参入了脑出血后炎症反应,可能会成为一个新的治疗目标。
【图文】：

检测时间,显著性差异,对照组

逑最多，３天时^u始下降。ＷＴ脑出血组同ＷＴ对照组组比较，Ｔｉｍ－３．阳性细胞数逡逑在各检测时间点均有显著性差异（尸＜0．0１）。（图１－Ａ，Ｂ）在出血后１２小时、１逡逑天、３天、５天和７天，应用ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＲＴ－ＰＣＲ方法检测血肿周围脑组织中Ｔｉｍ－３逡逑ｍＲＮＡ的表达。结果显示Ｔｉｍ－３邋ｍＲＮＡ的变化趋势同Ｔｉｍ－３阳性细胞变化相同，逡逑ＷＴ脑出血组小鼠的一ＮＡ在出血后１２小时的表达明显升高，在！天时逦＜逡逑达高峰，在３天时下降，同ＷＴ对照组比较有显著性差异（尸＜０．０１）。（图２）。逡逑：■■■■■逡逑■■■■■逡逑１２邋ｈ逦Ｉｄ逦３ｄ逦５ｄ逦７ｄ逡逑Ｔ＾００００＂逦＊＊逡逑｜｜邋３逦０邋ＷＴ邋ｓｈａｍ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｉ邋＾逦Ｈ＇．ＶＴ邋ＩＣＨ邋ｇｒｏｕｐ逡逑５＾００－逦★★逡逑（Ｎ逦＿逡逑Ｍ邋？＊00邋００－逡逑＾邋１邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ逡逑１２邋ｔｉ逦ｉｄ逦３ｄ逦５逦ｄ逦？ｄ逡逑Ｔｉｍｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ逡逑图１．小鼠脑出血后各检测时间点Ｔｉｍ－３阳性细胞的表达。Ａ）和Ｂ）：免疫荧光染色显示逡逑Ｔｉｍ－３阳性细胞数（Ｙ±Ｓ）在ＷＴ脑出血组从出血后１２小时开始升高，１天时最多，３天时开逡逑始下降，同ＷＴ对照组比较有显著性差异（＊＊Ｐ＜０．０１）。逡逑２４逡逑

检测时间,显著性差异,对照组,免疫荧光染色

一ＮＡ在出血后１２小时的表达明显升高，在！天时逦＜逡逑达高峰，在３天时下降，同ＷＴ对照组比较有显著性差异（尸＜０．０１）。（图２）。逡逑：■■■■■逡逑■■■■■逡逑１２邋ｈ逦Ｉｄ逦３ｄ逦５ｄ逦７ｄ逡逑Ｔ＾００００＂逦＊＊逡逑｜｜邋３逦０邋ＷＴ邋ｓｈａｍ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｉ邋＾逦Ｈ＇．ＶＴ邋ＩＣＨ邋ｇｒｏｕｐ逡逑５＾００－逦★★逡逑（Ｎ逦＿逡逑Ｍ邋？＊00邋００－逡逑＾邋１邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ逡逑１２邋ｔｉ逦ｉｄ逦３ｄ逦５逦ｄ逦？ｄ逡逑Ｔｉｍｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ逡逑图１．小鼠脑出血后各检测时间点Ｔｉｍ－３阳性细胞的表达。Ａ）和Ｂ）：免疫荧光染色显示逡逑Ｔｉｍ－３阳性细胞数（Ｙ±Ｓ）在ＷＴ脑出血组从出血后１２小时开始升高，１天时最多，３天时开逡逑始下降，同ＷＴ对照组比较有显著性差异（＊＊Ｐ＜０．０１）。逡逑２４逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.34

【参考文献】