碳点介导的二维及三维细胞神经转分化研究

发布时间：2020-03-23 13:03

【摘要】：病毒载体存在诱发基因突变的风险,而非病毒纳米基因载体具有优异的安全性,因此相关研究受到关注。近年来,不少研究报道了应用阳离子化多糖作为基因载体携载特定基因进行细胞重编程。多糖具有良好的安全性和低细胞毒性,因此多糖来源的阳离子化碳点,不仅可实现安全的基因传递,碳点自身的荧光性能可将基因传递的过程可视化。阳离子化碳点有望开发为兼具基因传递与生物成像功能的新型非病毒纳米基因载体。然而目前尚未有利用碳点作为非病毒纳米基因载体应用于诱导细胞神经定向分化的研究,因此本课题以天然紫菜多糖为碳源,乙二胺为阳离子化试剂和表面钝化剂,通过水热法制备带正电荷的碳点,并对碳点进行表征和基因载体性能的考察。在此基础上,以碳点作为非病毒纳米基因载体,将Ascl1、Brn2、Sox2质粒以不同的质粒组合导入外胚层间充质干细胞,进行细胞的定向神经诱导,体外获得神经细胞,为由损伤或疾病引起的神经元损伤的治疗提供种子细胞。此外,细胞的体内生长环境是三维体系,与一般的体外二维培养体系存在巨大差异,因此体外利用组织工程材料进行细胞的三维培养能最大程度模拟体内环境,为细胞体内移植奠定研究基础。对于由外力冲击造成的神经损伤,如脊髓损伤,损伤部位形成缺口,需要生物相容性好且有利于细胞粘附、增殖和迁移的组织工程支架携载细胞移植到缺损部位进行损伤的修复治疗,良好的组织工程支架能够抑制细胞凋亡和组织损伤引起的炎症反应,为神经再生提供良好的环境。为此本课题以海藻酸钠和明胶为原料,通过调节不同的配方制备适合诱导性神经细胞生长的水凝胶,为后续将优化的水凝胶携载诱导性神经细胞移植至大鼠脊髓半横断部位进行脊髓损伤修复提供初步研究基础。第一章综述本章主要阐述了碳点的制备方法、理化性质以及目前的应用,重点介绍碳点优异的理化性质以及在生物成像的应用,为碳点作为多功能非病毒纳米基因载体的应用提供可行性参考;同时简单介绍目前体外获取神经细胞的方法,包括多能干细胞的定向分化和体细胞重编程,为利用碳点携载特定质粒进行间充质干细胞转染提供依据;介绍目前用于治疗脊髓损伤的生物支架,为支架材料的选择提供参考;最后提出课题的选题依据和思路,为论文工作的开展奠定基础。第二章碳点的制备及表征本章采用紫菜多糖为原料,乙二胺作为阳离子修饰剂,通过水热法制备阳离子化碳点。通过测定紫外-可见吸收光谱、荧光发射和激发光谱以及荧光量子产率,对碳点的荧光性能进行考察,红外光谱和含氮量的测定说明了碳点的表面修饰和结构组成。本课题制备得到的碳点具有激发光波长依赖性荧光性质,在不同的激发光下显示红色,绿色和蓝色三种荧光,碳点表面经阳离子化修饰,荧光量子产率高达56.3%,具有优异的光学性能。第三章碳点的基因载体性能研究本章主要围绕碳点的基因载体性能展开研究。通过琼脂糖凝胶电泳考察阳离子化碳点对质粒DNA结合能力,碳点与质粒DNA以10:1的比例混合即可对DNA进行有效的结合。通过测定自组装纳米粒的粒径、Zeta电位和扫描电镜,对碳点/pDNA自组装纳米粒进行表征,结果显示碳点的平均粒约径为4 nm,自主装纳米粒约为14 nm,碳点和自组装纳米粒均带正电荷,呈规则的球形,分散性好。此外,考察自组装纳米粒的毒性和细胞转运机制,与市售的阳离子转染试剂相比,自主装纳米粒的毒性更低,几乎无细胞毒性;自组装纳米粒通过小窝蛋白和网格蛋白介导的内吞作用进入细胞,发挥基因传递的作用。第四章碳点/pDNA纳米粒介导EMSCs向神经细胞定向分化研究本章以碳点作为基因载体,分别与由Ascl1、Brn2、Sox2组成的7组质粒组合自组装形成纳米粒,进行外胚层间充质干细胞(EMSCs)的转染。通过观察细胞形态变化,ELISA和Western blot测定特定神经蛋白的表达,确定最优的转染组合;经免疫荧光,免疫组化和RT-PCR鉴定诱导获得的神经样细胞。结果显示,由Ascl1和Brn2组成的AB组合可更有效的诱导EMSCs向神经元样细胞分化,诱导获得的神经元样细胞表达Tuj1,Map2,Tau,Gap-43和NF200;最后RT-PCR显示,与市售的阳离子转染试剂相比,碳点的细胞转染效率更高,具有显著性差异。第五章三维培养体系的初步探索本章以海藻酸钠和明胶为原料,以CaCl_2为促凝剂,制备复合水凝胶。通过测定凝胶时间和细胞毒性,对45组水凝胶的凝胶性质和生物相容性进行初步评价。接着,测定水凝胶的吸水率,溶胀率和降解速率,考察水凝胶的物理性质,进一步筛选出最佳水凝胶配方。最后将转染后的EMSCs与复合水凝胶混合成胶,制备载细胞水凝胶。观察不同培养时间水凝胶上细胞的存活和生长情况,比较二维和三维细胞神经转分化效率,初步考察水凝胶是否适宜细胞生长,为后续载细胞水凝胶的体内移植提供研究基础。
【图文】：

法制,激光,激光照射

前驱体的种类可将碳点的制备方法分为而下法常以石墨[4]、碳纳米管[5]等结构有法将其破碎成碳纳米粒，其中的物理和]和电化学[8]法等。而自下而上法是将小其中包括：水热法[9]，模板法[10]，微波用激光束的能量对碳前驱物进行照射和[13]采用激光照射石墨薄片，激光照射结分别为 3 nm，8 nm和 13 nm 的碳量子同的荧光颜色，且这三种碳量子点均具过控制激光脉冲宽度可以对碳点的尺寸影响了碳点的成核条件和生长。并且与光器更适合不同材料体系中纳米结构的

水热法制备

图 1.3 水热法制备碳点[15]Figure 1.3 Preparation of CDs by hydrothermal method.1.1.4 模板法模板法是将碳前驱体置于模板的纳米空间进行碳化，碳化后将纳米粒与模离从而制备特定尺寸的碳点。碳纳米材料的制备是在特定尺寸的模板上进行此制备得到的材料一致性好、高度有序。Yang 等[16]以普朗尼克 P123 作为板，有序的介孔氧化硅 SAB-15 作为硬模板，选取 1,3,5-三甲苯(TMB)、二(DAB)、芘(PY)和邻二氮杂菲(PHA)作为碳源制备碳点。对制备得到的碳点氧化和钝化修饰，，修饰后的碳点具有 3.3～4.7%的光致发光效率和超高的光性。利用特定纳米尺寸的模板控制碳点的尺寸，在保证制备碳点的尺寸均一况下，通过多种有机前体对制备得到的碳点进行修饰，从而改变碳点结构、和发光特性，有助于进一步了解碳点表面态对碳点的发光的影响，从碳点表
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741;R318.08

【参考文献】