RTN1-C在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-03-27 07:53

【摘要】：背景:临床研究表明,在缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)中,缺血的组织或器官重新再恢复血液供给的话,会出现严重的机能障碍并伴随着组织损伤加重和炎症反应应答。而缺血再灌注损伤已成为当今世界致残和死亡的主要原因。已有研究发现RTNs家族蛋白可以诱导凋亡,抑制轴突再生和调节蛋白质运输。其中RTN1又被称为神经内分泌蛋白,并在脑组织中表达丰富。然而,对于RTNs在缺血再灌注中促进神经细胞凋亡的机制并不清楚。本研究我们发现RTN1-C在大鼠I/R模型和细胞氧糖剥夺再灌注模型(OGD/R模型)中均有特异性的升高,并可通过线粒体和内质网应激相关的通路诱导神经细胞凋亡。动物水平敲低RTN1-C可以减轻脑缺血再灌注损伤,这种减轻与线粒体及内质网应激相关的凋亡蛋白水平的降低密切相关。因此,RTN1-C参与到脑缺血再灌注中的损伤作用,其机制与诱导线粒体和内质网应激的凋亡通路有关。目的:探究RTN1-C在脑缺血再灌注中对神经细胞的影响,为脑缺血再灌注损伤的治疗方法提供新的线索。方法:通过免疫印迹和免疫荧光实验证明RTN1-C在脑缺血/再灌注中表达上调。在OGD/R模型中,将RTN1-C过表达后,免疫荧光,CCK-8,流式实验证明细胞凋亡增加并且细胞对缺血性损伤的易感性增加,而敲低RTN1-C后可以逆转由缺血诱导的细胞凋亡并减弱OGD/R处理的神经细胞的易感性。WB实验证明了在OGD/R模型中RTN1-C可以通过内质网应激和线粒体相关的通路诱导细胞凋亡。通过免疫沉淀实验证明了RTN1-C与Bcl-x L相互作用并增加其在ER中的定位,从而减少Bcl-x L抗凋亡的活性。在大鼠MCAO模型中,通过免疫荧光,TTC染色,大鼠的神经学评分实验证明敲低RTN1-C后大鼠神经细胞的凋亡率降低。结果:1.RTN1-C在脑缺血再灌注中表达呈特异性上调(1)蛋白免疫印迹:RTN1-C在脑缺血再灌注12小时和24小时,其表达逐渐增加,而RTN1-A和RTN1-B的表达没有变化。RTN1-C在脑损伤即脑缺血再灌注模型中呈高表达,在脑保护模型即缺血后处理和瑞芬太尼后处理组呈低表达。(2)免疫荧光染色:随着再灌注损伤时间的延长,分别取再灌注0小时,12小时,24小时后脑组织进行固定染色,RTN1-C(绿色)、DAPI(蓝色),图像重叠后显示:随着再灌注时间的延长,脑组织中RTN1-C的表达逐渐增加。2.在脑缺血再灌注中RTN1-C促进神经细胞的凋亡(1)免疫荧光染色:在脑缺血再灌注24h后对脑组织进行固定染色,其中RTN1-C(绿色)、活化的Caspase3(红色)、DAPI(蓝色),图像重叠后显示,与正常组相比,脑缺血再灌注24h后,活化的Caspase3阳性细胞数量明显增加。(2)细胞活力实验:CCK-8实验表明,在细胞OGD/R模型中,过表达RTN1-C后,神经细胞的活力降低,敲低RTN1-C后,神经细胞的活力升高。(3)流式实验:在细胞OGD/R模型中,将RTN1-C过表达后,神经细胞的凋亡增加,RTN1-C敲低后,神经细胞的凋亡降低。3.在OGD/R模型中,RTN1-C可以诱导内质网应激相关的凋亡(1)在N2a细胞中分别过表达RTN1-C和敲低RTN1-C后,然后进行OGD/R处理后,蛋白免疫印迹检测内质网应激相关蛋白Grp78,活化的Caspase-12,CHOP,活化的Caspase-3的表达,发现OGD/R处理后RTN1-C增加了Grp78,活化的Caspase-12,CHOP,活化的Caspase-3的表达。(2)为了进一步证实RTN1-C参与到内质网应激相关的凋亡,将N2a细胞过表达RTN1-C-GFP质粒,用内质网应激的抑制剂4-PBA处理6小时后,然后再进行OGD/R处理,之后蛋白免疫印迹检测Grp78,活化的Caspase-12,CHOP,活化的Caspase-3的蛋白水平。结果表明4-PBA处理后,Grp78,活化的Caspase-12,CHOP,活化的Caspase-3的表达显著抑制。4.在OGD/R模型中,RTN1-C可以诱导线粒体相关的凋亡(1)为了证明RTN1-C通过线粒体相关的凋亡途径参与到脑缺血再灌注损伤,Western blotting检测相关凋亡蛋白细胞色素C和活化的Caspase-3的水平,结果表明OGD/R处理后,胞质中细胞色素C的含量增加,线粒体内的细胞色素C含量减少,活化的Caspase-3的表达增加,而RTN1-C过表达后,胞质中细胞色素C和活化的Caspase-3的含量增加,反之敲低RTN1-C后,这些蛋白水平降低。(2)为了探究在OGD/R模型中,RTN1-C与Bcl-xL的相互作用情况以及RTN1-C是否改变Bcl-x L的亚细胞定位,通过免疫沉淀和WB实验,我们发现OGD/R处理后,RTN1-C与Bcl-x L的相互作用增强,胞质中Bcl-x L含量增加,而过表达RTN1-C后,从线粒体异位到胞质中Bcl-xL含量显著增加。5.在脑缺血再灌注模型中,敲低RTN1-C后可以降低细胞的凋亡(1)免疫荧光染色:为了进一步证明在大鼠I/R模型中RTN1-C敲低是否能够降低神经细胞的凋亡,组织免疫荧光实验结果表明,敲低RTN1-C后,与对照组相比活化的Caspase3阳性细胞数量明显减少。这说明敲低RTN1-C后可以下调神经细胞的凋亡。(2)TTC染色:为进一步探究敲低RTN1-C对脑缺血再灌注损伤的治疗效果,我们对大鼠脑组织进行TTC染色发现,在假手术组中未见梗死区域,而在再灌注24小时组中可见明显的苍白色的梗死病灶,与对照组相比,敲低RTN1-C后大脑的梗死面积明显降低。(3)神经功能评分:采用Bederson评分标准来对MACO大鼠模型中神经学功能进行评分并探究敲低RTN1-C是否参与神经损伤的保护作用,结果表明在感染Lv-shRTN1-C的MACO大鼠组中,与Lv-NC MACO大鼠组相比神经学功能明显改善。结论:本实验通过免疫荧光,蛋白免疫印迹,流式细胞技术等实验证实了RTN1-C在脑缺血再灌注中通过内质网应激和线粒体相关的凋亡促进神经细胞的凋亡,这为今后治疗脑缺血再灌注损伤提供了新的途径。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743

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本文编号：2602702