【摘要】：研究背景:胶质母细胞瘤(glioblastoma)是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤。生存期大多不足一年。目前虽然在手术、化放疗及分子治疗上都取得了一定的进展,但是大多数患者的预后仍然很差。肿瘤的高侵袭性和高复发率是主要致死原因。所以,了解胶质母细胞瘤的生物学特点和分子机制可以为预防和早期诊断奠定基础,同时,也为临床治疗和改善预后提供新的思路和途径。microRNA(miRNA)作为近几年的研究热点,在肿瘤中的研究虽然还处于起步阶段,但其作为原癌基因或抑癌基因在肿瘤发生发展及治疗和预后中的作用正被越来越的科学家们所关注,并期望其能够在肿瘤的诊断和治疗中提供必要的靶点支持。miRNAs的研究已经证实:miRNAs几乎参与肿瘤的所有重要生物学过程,包括:细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和侵袭、细胞分化和耐药等,而且它们的产生和表达受遗传变异、表观遗传调控和肿瘤微环境多种因素的影响。目前多种miRNA在胶质母细胞瘤中的作用陆续被报道。其中,miR-29、miR-124、miR-181、miR-7等在胶质母细胞瘤中起抑制肿瘤侵袭和肿瘤血管生成的作用;而miR-21、miR-10b、miR-221/222、miR-93等起促进肿瘤侵袭及肿瘤血管生成的作用。miR-16作为miRNA家族的一个成员,在慢性淋巴细胞白血病中首次被发现时,被认为是一抑癌基因。最近几年的一些研究发现:在胆管癌、膀胱癌、非小细胞肺癌等许多实体肿瘤中,miR-16的表达下调,提示miR-16可能是通过抑制靶基因作用参与肿瘤发生发展的。然而,也有部分研究者证实:.在胃癌、卵巢癌等一些肿瘤中miR-16的表达上调,对肿瘤有促进作用,发挥原癌基因的功能。这些研究说明miR-16可能存在器官特异性,在不同肿瘤中起抑癌基因或原癌基因的作用。至今miR-16在胶质母细胞瘤中的作用仍少有人报道。目前研究结论支持miR-16在胶质母细胞瘤中起抑癌基因的作用。主要作用方式是与靶基因特异性相结合,抑制肿瘤的机制也从细胞增殖、凋亡、细胞周期以及细胞侵袭和转移等不同方面有所发现。为了探讨miR-16在胶质母细胞瘤中的作用及可能的分子机制,本研究通过数据库TargetScan和miRanda将miR-16的目的基因进行预测并筛选,结果显示:Wip-1的3'-UTR能够特异性地与miR-16的5'-UTR相互结合,提示miR-16与Wip1存在一定的靶向关系。Wip1是PP2C(protein phosphatase2C)家族的一种蛋白磷酸酶,作用于丝氨酸(Serine)/苏氨酸(Threonine)位点。Wip1是一种原癌基因,在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。ATM和p53作为公认的抑癌基因,已经被证实都是Wip1的靶基因。Wip1通过去磷酸化ATM和p53,使二者失去活性,进而促进肿瘤的发生发展。基于以上研究背景,本文提出科学假说:miR-16靶向调控Wip1介导Wip1-ATM-p53信号通路抑制胶质母细胞瘤生长。在信号传导中,蛋白质可以通过获得磷酸基团而被激活;通过去除磷酸基团而失去活性。如前所述,Wip1是一种丝/苏氨酸位点的蛋白磷酸酶,通过对靶蛋白的去磷酸化作用行使癌基因的功能。而ATM和P53都是Wip1的靶蛋白,能被Wip1去磷酸化而抑制。在胶质母细胞瘤中磷酸化ATM(p-ATM)和磷酸化P53(p-P53)的蛋白表达水平究竟有无变化,也将是本研究要探讨的一个问题。为此,本文从体外细胞功能实验验证miR-16与Wip1-ATM-p53信号通路对胶质母细胞瘤细胞增殖、侵袭、凋亡和细胞周期的作用,体内裸鼠原位移植瘤实验进一步验证miR-16的抑瘤作用,初步探讨miR-16抑制胶质母细胞瘤的分子机制。目的:本文旨在探讨miR-16靶向调控Wip1-ATM-p53信号通路,及其在抑制胶质母细胞瘤生长、侵袭中的作用及可能的分子机制。方法:采用SHG44、U87和U251三株胶质母细胞瘤的细胞系,通过细胞转染建立miR-16高表达组及其对照组,分别进行细胞克隆形成实验、EDU细胞增殖实验、细胞侵袭实验、细胞凋亡实验和细胞周期实验。利用生物信息数据库对miR-16的基因调控网络进行分析,并对靶基因进行预测:Wip1可能是miR-16的靶基因。miR-16与Wip1的靶向关系通过双荧光素酶报告基因实验进行验证。体外细胞实验分为两组(miR-16mimic组和对照组),应用qRT-PCR检测各组Wip1、ATM和p53 mRNA表达;应用Western blot检测各组Wip1、ATM、P53、p-ATM和p-P53蛋白表达。体外实验将裸鼠分5组,miR-16高表达组(agmir组)、低表达组(antagomir组)及各自相对应的对照组(NC组)和空白对照组(control组)。裸鼠原位移植瘤应用Western blot实验,分别检测各组Wip1、ATM、P53、p-ATM和p-P53蛋白表达;qRT-PCR和免疫组织化学(immunohistochemistry)分别检测各组Wip1、ATM、p53的mRNA和蛋白表达。结果:高表达miR-16的SHG44、U87和U251三株细胞,与NC组相比,细胞克隆形成数均显著减少(t=1 1.300,p0.01;t=8.812,p0.01;t=11.857,p0.01);细胞增殖数均显著下降(t=26.67,p0.01;t=10.776,p0.01;t= 10.096,p0.01);细胞的侵袭细胞数减少(t=6.683,p0.01;t=8.181,p0.01;t=7.578,p0.01);早期细胞凋亡率显著升高(t=4.918,p0.05;t=4.006,p0.05;t=3.573,p0.05);处于 G1期细胞数明显增多(t=6.392,p0.05;t=9.802,p0.05;t=8.975,p0.01),S 期细胞数明显减少(t=4.643,p0.05;t=6.284,p0.05;t=5.009,p0.01)。双荧光素酶报告基因结果表明过表达miR-16时,野生型Wip1的荧光素酶活性与NC组比较显著降低(t=4.481,p0.05);突变型Wip1的荧光素酶活性与NC组相比差异不明显(t=0.693,p0.05)。Wip1是miR-16特异结合靶点。体外细胞qRT-PCR实验结果表明过表达miR-16与对照组相比,三种细胞的 Wip1 的 mRNA 表达降低(t=8.589,p0.01;t=8.034,p0.01;t=7.727,p0.01),ATM 的 mRNA 表达升高(t=4.304,p0.05;t=7.407,p0.05;t=6.530,p0.05),同时 p53 的 mRNA 表达也升高(t=4.879,p0.01;t=5.946,p0.01;t=4.818,p0.01)。Western blot 实验结果表明过表达 miR-16 与对照组相比,Wip1 蛋白表达降低(t=9.918,p0.01;t=5.646,p0.01;t=5.609,p0.01),p-ATM 蛋白表达升高(t=4.785,p0.01;t=9.484,p0.01;t=4.464,p0.05),同时 p-P53 蛋白表达也升高(t=3.848,p0.05;t=3.024,p0.05;t=4.222,p0.05)。而 ATM 蛋白表达差异不明显(t=1.938,p0.05;t=2.152,p0.05;t=2.670,p0.0),P53 蛋白表达差异也不明显(t=2.589,p0.05;t=2.189,p0.05;t=1.859,p0.05)。裸鼠颅内原位移植瘤实验表明空白对照组与正常脑组织相比,裸鼠颅内原位成瘤中的miR-16明显减低(t=2.836,p0.05)。miR-16过表达组肿瘤体积明显小于NC组(t=9.643,p0.01),miR-16低表达组肿瘤体积明显大于NC组(t=13.29,p0.01)。qRT-PCR结果表明miR-16过表达组的Wip1基因表达下调(t=8.515,p0.05),而ATM和p53基因表达上调(t=5.430,p0.05;t=5.213,p0.05);与其形成对比的是,miR-16低表达组的Wip1基因表达水平明显高于其NC组(t=3.690,p0.05),而ATM和 p53 基因表达水平低于其 NC 组(t=3.106,p0.05;t=2.808,p0.05)。Western blot实验结果表明Wip1蛋白在miR-16过表达组表达下调(t=5.383,p0.01),而 p-ATM 和 p-P53 蛋白表达上调(t=4.35,p0.01;t=2.648,p0.05);反之,Wip1蛋白在miR-16低表达组表达上调(t=6.200,p0.01),而p-ATM和 p-P53 蛋白表达下调(t=5.828,p0.01;t=4.537,p0.01);ATM 和 P53 的蛋白表达量在miR-16高表达(t=1.133,p0.05;t=-0.019,p0.05)和低表达(t=0.149,p0.05;t=-0.157,p0.05)时组间差异不显著。免疫组化实验结果显示Wip1蛋白在miR-16过表达时的表达减弱(t=2.428,p0.05),而p-ATM 和 p-P53 蛋白在 miR-16 过表达时表达增强(t=2.291,p0.05;t=2.494,p0.05);相反,miR-16 低表达时,Wip1 蛋白表达增强(t=2.352,p0.05),而 p-ATM 和 p-P53 蛋白表达减弱(t=2.397,p0.05;t=2.013,p0.05);ATM和 P53 蛋白在 miR-16 高表达(t=1.423,p0.05;t=0.158,p0.05)和低表达(t=0.935,p0.05;t=0.458,p0.05)时组间差异均不显著(p0.05);结论:(1)miR-16抑制胶质母细胞瘤SHG44、U87和U251细胞的增殖和侵袭能力。(2)Wip1是miR-16的靶基因,miR-16通过调控Wip1-ATM-p53信号通路抑制胶质母细胞瘤生长。
【图文】：
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图３过表达ｍｉＲ－１６抑制ＳＨＧ４４、Ｕ８７和Ｕ２５１细胞的增殖能ＥＤＵ增殖实验中，与对照组（ＮＣ组）相比，过表达ｍｉＲ－１６组的ＳＨ７邋和邋Ｕ２５１邋细胞的增殖显著下降（ｔ＝２６．６７，ｐ＜０．０１；ｔ＝１０．７７６，，ｐ＜０．０１；ｔ＝．０１），结果表明过表达ｍｉＲ－１６抑制ＳＨＧ４４、Ｕ８７和Ｕ２５１细胞的
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4
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2602756
