miR-584-5p在胶质瘤中的作用机制及其转化应用的研究

发布时间：2020-03-27 22:02

【摘要】：研究背景和目的:胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,占所有脑部肿瘤的30%到40%,占颅内恶性肿瘤的80%左右,在所有胶质瘤中,大约有50%以上属于恶性程度最高的胶质母细胞瘤。胶质瘤具有发病率高,术后复发率高,病死率高和治愈率低的特点。WHO中枢神经系统肿瘤分类将胶质瘤分为WHO Ⅰ级到Ⅳ级,其中Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤称为高级别胶质瘤,其预后极差,诊断后中位生存期仅为12至16个月。2017年欧洲神经肿瘤协会发布了包括胶质母细胞瘤在内的成人弥漫性胶质瘤诊断和治疗的最新建议。根据此建议,胶质瘤手术的目标是尽可能地将肿瘤组织全部切除。但究竟是因为手术方式的不同,还是因为其本身具有较低的侵袭性使得宏观上可全部切除的肿瘤与那些不能完全切除的肿瘤相比的预后较好,目前仍旧存在争议。除了手术治疗,对于新诊断的年龄≤70岁,具有良好神经功能状态的成年患者,常规放疗加用TMZ化疗已成为标准治疗方案。即便如此,胶质母细胞瘤患者最终都会复发。从胶质母细胞瘤首次进展或复发算起,患者的中位生存期仅有6-9个月。事实上,目前没有证据表明在胶质母细胞瘤复发的情况下,任何治疗干预措施能延长患者的生存期。因此,迫切需要寻找治疗胶质瘤的新方法。microRNA(miRNA)是一类非编码的微小RNA,通过与互补靶mRNA结合导致mRNA翻译抑制或降解,从而在细胞分化,增殖和凋亡等多种生物过程中发挥核心作用。随着研究的深入,miRNA在肿瘤的发生发展中也起着关键的作用,它们不仅可以直接调控肿瘤发生发展的各种重要的信号通路,也可以通过影响肿瘤生长的微环境来调节肿瘤的生长。本研究旨在寻找在胶质瘤发生发展中起关键作用的miRNA,阐明其在胶质瘤中的作用机制,同时寻找能影响此miRNA的表达的药物,为临床转化做初步准备。第一部分:miR-584-5p胶质瘤中的作用:我们首先访问并下载了 TCGA数据库中胶质瘤miRNA表达谱的数据,选取了表达量明显下降并且功能尚未在胶质瘤中进行验证的miRNA。用qRT-PCR的方法检测这些miRNA在本课题组收集的胶质瘤组织与正常组织中的表达,最后选择表达差异最显著的miR-584-5p为研究对象。随后,我们用qRT-PCR的方法检测了 100例胶质瘤组织,34例胶质瘤癌旁组织以及8例正常脑组织中miR-584-5p的表达。结果显示,miR-584-5p的表达与胶质瘤的WHO分级,胶质瘤患者的预后以及年龄相关。胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级),预后差以及年龄大的患者miR-584-5p的表达更低。CCK-8实验以及平板集落形成实验结果表明,miR-584-5p能抑制胶质瘤细胞U251与U87MG的增殖。划痕实验与Transwell实验结果表明,miR-584-5p能抑制胶质瘤细胞系U251和U87MG的迁移。流式细胞技术结果表明,miR-584-5p能促进U87MG细胞的凋亡。低粘附板成球实验结果表明miR-584-5p能抑制U251和U87MG细胞系的干性。裸鼠成瘤实验结果表明miR-584-5p能抑制U87MG细胞的裸鼠体内成瘤的能力。第二部分:miR-584-5p靶蛋白的寻找及验证:我们将TargetScan与miRwalk预测的miR-584-5p靶基因取交集,将这些基因的名称输入cBioPortal网站,查询其在胶质瘤中的表达量,并选出在胶质瘤中表达上调的基因。最后查寻文献,确定这些基因是在其他肿瘤中起促癌作用。最终我们选出了 11个基因,并在细胞水平做进一步验证。将miR-584-5p在U251细胞系以及U87MG过表达后用qRT-PCR的方法检测这11种基因的表达,结果只有Jagged1基因在两个细胞系中的表达均下降。随后,我们构建了 Jagged1与miR-584-5p结合的双荧光报告系统。双荧光结果显示miR-584-5p能识别并与Jagged1的3' UTR结合进而降解Jagged1的mRNA。Western Blot的结果表明miR-584-5p过表达后U251细胞系中Jagged1蛋白表达水平降低。不仅如此,miR-584-5p过表达后的U87MG细胞裸鼠成瘤的肿瘤组织中Jagged1的表达量也明显低于对照组。第三部分:miR-584-5p靶基因Jagged1在胶质瘤中的作用:我们用qRT-PCR的方法检测了 100例胶质瘤组织,34例胶质瘤癌旁组织以及8例正常脑组织中Jagged1 mRNA的表达。结果显示Jagged1的表达与胶质瘤的分级,胶质瘤患者的预后相关。胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级),预后差的患者Jagged1的表达更高。免疫组化结果也显示Jagged1蛋白在高级别胶质瘤中表达高并且与患者的预后相关。CCK-8实验以及平板集落形成实验结果表明,Jagged1能促进胶质瘤细胞U251与U87MG的增殖。划痕实验与Transwell实验结果表明Jagged1能促进胶质瘤细胞系U251和U87MG的迁移。流式细胞技术结果表明Jagged1能抑制U251和U87MG细胞的凋亡。低粘附板成球实验结果表明Jagged1能促进U251和U87MG细胞系的干性。裸鼠成瘤实验结果表明Jagged1能促进U87MG细胞的体内成瘤能力。第四部分:Compound C能升高miR-584-5p发挥抑制胶质瘤的作用:我们用终浓度分别为5μM,10μM和20μM的Compound C刺激胶质瘤细胞系 U251 和 U87MG 12h,24h 和 48h。用 qRT-PCR 的方法检测 miR-584-5p 的表达量。结果显示,随着Compound C用量的增加以及用药时间的延长,两株细胞中的miR-584-5p的表达量上升。其中最佳的Compound C的浓度为10μM,用药时间为48h,在这个条件下U251细胞的Jagged1蛋白明显下调。Compound C 10mg/Kg腹腔注射U87MG细胞成瘤11天后的裸鼠,能明显抑制肿瘤的生长。将Compound C组以及对照的PBS组成瘤的组织制成蜡块,切片后用免疫组化的方法检测了组织中Jagged1的表达,结果显示PBS组中的Jagged1的表达量高于 Compound C 组。全文结论:1.miR-584-5p在胶质瘤组织中低表达,并且与胶质瘤患者的预后和年龄相关。miR-584-5p能抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和干性,并且能抑制胶质瘤细胞系U87MG的成瘤能力。2.miR-584-5p能识别并与Jagged1的3'UTR结合,造成Jagged1的表达下调。在胶质瘤组织中miR-584-5p与Jagged1的表达呈负相关。3.Jagged1在胶质瘤组织中高表达,并且与胶质瘤患者的预后相关,Jagged1能促进胶质瘤细胞的增殖,迁移和干性,并且促进胶质瘤细胞U87MG的成瘤能力。4.Compound C能上调miR-584-5p的表达并且降低Jagged1的表达,能抑制U87MG细胞的成瘤能力。
【图文】：

表达水平,胶质瘤

选取／邋５例正常脑组织，，１９例ＩＩ级胶质瘤组织，１８例１丨丨级胶质瘤组织以及逡逑３８邋例ＩＶ级胶质瘤组织进－步检测邋ｍｉＲ－５８４－５ｐ，ｍｉＲ－１３３ａｍｉＲ－１３３ｂ，ｍｉＲ－１８７，逡逑ｍｉＲ－１９８，邋ｍｉＲ－６３７，ｍｉＲ－４０９－５ｐ的表达情况（图１．２），最后选取表达差异最为逡逑显著的ｍｉＲ－５８４－５ｐ为研究对象，进行后续实验。逡逑正常邋丨丨级逦丨丨丨级逦ＩＶ}逡逑ｍｉＲ－１３３ａ邋［Ｈ逦｜逦Ｉ邋１１逦Ｉ邋ｋ邋ｌ邋＼邋Ｈ邋３0逡逑—■W■邋ｉ逡逑－１邋Ｍ邋Ｅｉ！邋ｉ邋ｉ邋ｌ邋｜２0ｔ逡逑三邋ｌａｉ＿Ｍ１逡逑图１．２邋ｑＲＴ－ＰＣＲ检测７种ｍｉＲＮＡ的表达水平逡逑３．２邋ＴＣＧＡ数据库中ｎｉｉＲ－５８４－５ｐ在胶质瘤中的表达以及对患者预后的影逡逑响逡逑从ＴＣＧＡ数据库网站上获取胶质瘤ｍｉＲＮＡ表达谱数据后，我们对逡逑ｍｉＲ－５８４－５ｐ在５例正常脑组织以及５３３例低级别胶质瘤（ＷＨＯ分级不到ＩＶ级的逡逑胶质瘤）的表达情况进行了分析，如图１．３Ａ所示，ｍｉＲ－５８４－５ｐ在胶质瘤组织中逡逑显著下降。随后我们这５３３例低级别胶质瘤患者的随访信息，去除无随访信息逡逑的患者，共获得３１５例患者进行生存分析。以ｍｉＲ－５８４－５ｐ表达的中位数将３１５逡逑例患者分为高表达组（ｎ＝］５８）与低表达组（ｎ＝１５７），结果显示，低表达组患者逡逑预后更差（图１．３Ｂ）逡逑１４逡逑

胶质母细胞瘤,胶质瘤,脑组织,与非

ＩＩ级（１．４９±０．邋２２）与ＩＶ级组织中（０．７６±０．邋１２）的表达有统计学差异（图丨．４Ｃ）；逡逑若对比胶质母细胞瘤（ＷＨＯ邋ＩＶ级）与非胶质母细胞瘤（１．４２±０．２１），则逡逑ｍｉＲ－５８４－５ｐ在胶质母细胞瘤中表达量更低（图１．４Ｄ）逡逑１５逡逑
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

【相似文献】