顺铂诱导神经母细胞瘤细胞衰老及作用机制的实验研究

发布时间：2020-03-30 07:06

【摘要】：研究背景和目的:神经母细胞瘤是儿童时期常见的颅外实体肿瘤,高危患儿预后差,积极综合治疗长期存活率仍然较低,增加化疗强度,并没有显著地改善高危患儿的长期生存状况,而且大剂量的化疗药物可能会对患儿产生严重的毒副作用。减少化疗药物剂量不能直接诱导细胞凋亡,但可诱导细胞出现衰老而暂时抑制肿瘤细胞地恶性增殖,同时降低相关毒副作用。本实验拟探讨小剂量化疗药物顺铂是否能诱导神经母细胞瘤细胞衰老及其作用机制。研究方法:选择NMYC基因扩增的神经母细胞瘤细胞系(IMR32)为研究对象,利用噻唑蓝比色法(MTT)和流式细胞术检测不同浓度的顺铂对细胞生长和细胞周期的影响。利用显微镜观察顺铂作用下细胞的形态学变化,并拍照记录。利用用衰老相关-β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色方法检测细胞衰老情况。利用蛋白质免疫印迹(Western Blot)方法检测衰老细胞内NMYC及p-NMYC蛋白水平的表达情况。利用RT-PCR及Western Blot等技术研究与衰老相关分泌表型(senescence-associated sectroy phenotype,SASP)现象密切相关的IL-6/STAT3信号通路。结果:1、MTT结果提示不同浓度(0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L和5μmol/L)顺铂处理IMR32细胞后,24 h以内各组细胞增殖速度无明显差异。浓度为5μmol/L组在作用48 h后细胞增殖出现明显抑制,72 h时表现更为明显;2μmol/L组在48 h后细胞增殖速度明显减缓,与0.5μmol/L组和1μmol/L组比较有显著差异,72 h出现明显增殖抑制;0.5μmol/L组对细胞增殖没有明显影响。2、流式细胞分析显示不同浓度(0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L和5μmol/L)顺铂处理IMR32细胞48 h后,细胞周期在G2/M期的细胞分别占30.95%、57.58%、70.14%和38.69%,与对照组(G2/M期细胞占10.76%)比较有明显差异。其中以浓度为2μmol/L组G2/M期阻滞率最高,占70.14%,同时凋亡检测显示细胞凋亡不明显。而浓度为5μmol/L组阻滞率为38.69%,凋亡检测显示凋亡细胞明显增多。3、小剂量顺铂(2μmol/L)作用于细胞24 h时,镜下观细胞形态改变不明显,而作用48 h之后,显微镜下观察可见细胞形态发生明显变化,与对照组相比,细胞数量减少,细胞体积明显增大,没有明显细胞死亡。SA-β-gal衰老细胞染色可见给药组蓝染细胞数明显多于对照组,说明小剂量顺铂在一定作用时间内能够诱导IMR32细胞出现衰老。4、收集顺铂(2μmol/L)作用不同时间段的细胞进行Western Blot实验,结果显示药物作用6 h和24 h时,与对照组相比,加药组细胞内NMYC及p-NMYC蛋白无明显变化,随着药物作用时间延长,在作用48 h以后NMYC及p-NMYC蛋白呈现下降趋势。5、与SASP相关的最突出的细胞因子是白细胞介素6(interleukin 6,IL-6),PCR实验结果提示与对照组相比,在药物作用24 h后细胞中IL-6 mRNA表达水平有所升高。结论:1、不同浓度顺铂可抑制神经母细胞瘤细胞增殖,其中小剂量顺铂主要通过将细胞周期阻滞于G2/M期,而大剂量顺铂主要通过引起细胞凋亡而抑制肿瘤细胞增殖。2、小剂量顺铂可诱导神经母细胞瘤细胞出现衰老,进而抑制肿瘤生长,而且NMYC蛋白在衰老的细胞中表达下调,伴有IL-6 mRNA表达水平的升高。
【图文】：

MR32 细胞增殖的影响 方法初步检测不同浓度（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmo不同时间点（0 h、6 h、24 h、48 h 和 72 h）IMR32 细同浓度的顺铂作用于 IMR32 细胞 24 h 以内细胞活力，不同浓度处理组的细胞生长曲线逐渐出现差异，以 5药物作用时间的延长，其细胞增殖活力明显受到抑制 细胞的增殖活力也具有抑制作用，其中作用 48 h 的 2 减缓，而且与 1 μmol/L 和 0.5 μmol/L 顺铂作用有显著.01873），72 h 出现明显增殖抑制作用。浓度为 0.5 μm，见图 1。由此可见，顺铂浓度为 2 μmol/L 以上时，的增殖有明显的抑制作用。

亡不明显的情况下，对细胞的增殖有明显的周期阻滞作用，而5 μmol/L组抑制细胞增殖的原因可能与诱导凋亡有关。图2.A 流式细胞术检测各组细胞周期； B 流式细胞术检测各组细胞凋亡2.4.3 顺铂诱导IMR32细胞衰老的作用研究处于衰老状态的细胞通常表现为细胞的体积变大呈现扁平状态、细胞核膜内陷、细胞器变形，并且表达在 PH 6.0 时有高酶活性的 β-半乳糖苷酶，催化底物 X-Gal 生成深蓝色沉积产物[26]。为了检测顺铂对 IMR32 细胞的衰老诱导效应，，本研究根据 MTT及流式细胞术的实验结果确定了 2 μmol/L 为顺铂进一步实验的作用浓度，利用 2μmol/L 的顺铂处理 IMR32 细胞，观察顺铂作用不同时间后细胞形态的改变，并且选择作用 48 h 之后进行细胞衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）试剂盒染色，观察细胞衰老情况。药物处理细胞后置于显微镜下观察，并于 40 倍镜头下与对照组相比
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4

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本文编号：2607224