泛素羧基端水解酶L5在脑胶质瘤发生发展中的作用及机制研究

发布时间：2020-03-30 13:42

【摘要】：作为细胞内主要的蛋白质降解途径,泛素蛋白酶系统(UbiquitinProteasome System,UPS)包括26S蛋白酶体、去泛素化酶(Deubiquitinase,DUBs)'泛素分子、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3。DUBs是一组能够水解泛素羧基端的酯键、肽键和异肽键并将泛素分子从蛋白质上移除的蛋白酶家族。泛素竣基端水解酶 L5(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5,UCH-L5)是去泛素化酶家族成员之一。UCH-L5通过从多聚泛素链的远端亚基逐个去除泛素分子,对于蛋白降解的调节具有双重性,一方面通过移除标记蛋白的泛素分子从而抑制蛋白降解;另一方面通过适当移除泛素分子从而使得被泛素标记的蛋白具有有利于进入蛋白酶体的构象从而促进蛋白质的降解。当UCH-L5结合蛋白酶体19S调节亚基的Rpn13/Admr1受体时,UCH-L5活性增强;当UCH-L5与INO80复合物的NFRKB亚基结合时,其活性受到抑制。但是UCH-L5在脑胶质瘤发生发展中的作用及机制尚不清楚。本研究对19例冷冻和51例石蜡包埋的临床病理切片进行分析,结果表明与正常脑组织相比,UCH-L5在脑胶质瘤组织中呈低表达。在体外实验中,UCH-L5可抑制胶质瘤细胞系U87MG、U251细胞的迁移和侵袭功能。我们选择SNRPN,SNRPF和CKLF作为UCH-L5的靶向候选基因,该三种基因已被证明在胶质瘤或其他肿瘤中异常表达。我们发现,干扰SNRPF,SNRPN或CKLF的表达可抑制U87MG细胞的迁移和侵袭能力;而干扰UCH-L5的表达可上调SNRPF的mRNA和蛋白水平,并且UCH-L5调节SNRPF在迁移和侵袭的功能在U87MG细胞得到了进一步证实,随后在293T细胞中证实UCH-L5过表达可以下调SNRPF蛋白水平,因此本研究认为UCH-L5通过下调SNRPF从而抑制胶质瘤细胞系的迁移和侵袭功能。同时,我们也发现UCH-L5可以下调包括SNRPF等8种基因在内的Sm家族的mRNA水平表达。UCH-L5的活性受NFRKB调节,我们发现在U87MG和U251 细胞中,NFRKB-siRNA 影响 UCH-L5 和 SNRPF 的 mRNA 水平,NFRKB-siRNA下调SNRPF的mRNA水平,因此我们推测,UCH-L5调节SNRPF的mRNA的表达可能受到NFRKB的调节。目前UCH-L5在胶质瘤发生中的具体作用和调节机制尚未完全阐明,因此,进一步研究UCH-L5的生物学功能能够为相关疾病的治疗提供新的思路,具有重要的临床意义。
【图文】：

ｑＰＣＲ技术分析样本中的ＵＣＨ－Ｌ５水平，３例正常脑组织和随机选取的５例脑胶质逡逑经Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技术分析ＵＣＨ－Ｌ５的蛋白水平。结果表明：与正常脑组织相比，，逡逑ＵＣＨ－Ｌ５的ｍＲＮＡ水平（图３．１Ａ）和蛋白质水平（图３．１Ｂ）在脑肢质瘤组织中水逡逑平较低。我们将４例正常脑组织和４７例胶质瘤组织做成组织芯片（ＴＭＡ），进行逡逑免疫组化实验，上述正常脑组织和脑胶质瘤组织中ＵＣＨ－Ｌ５的表达差异经免疫组逡逑化得到进一步证明（图３．１Ｃ）。这些结果表明，脑组织中ＵＣＨ－Ｌ５低表达与胶质瘤逡逑的发生呈正相关，但在低级别胶质瘤和高级别胶质瘤之间无差异（图３．１Ｃ）。表１逡逑和表２显示冷冻样本和石蜡包埋样品的详细资料，包括数目、肿瘤级别、肿瘤类逡逑型和病人年龄。逡逑１４逡逑

病毒的感染效率经检测ＧＦＰ表达率证明均超过９０％。稳定干扰和稳定过表达逡逑ＵＣＨ－Ｌ５的单克隆细胞通过嘌呤霉素进行筛选得到并作为后续的实验材料。慢病毒逡逑介导的稳定干扰和过表达效率在Ｕ８７ＭＧ细胞中分别为７０％和２倍（图３．８Ａ）。慢逡逑病毒介导的稳定干扰和过表达效率在Ｕ２５１细胞中分别为６０％和３倍（图３．８Ｂ）。逡逑相应地，我们发现ＵＣＨ－Ｌ５显著抑制Ｕ８７ＭＧ细胞（图３．８Ｃ和图３．８Ｅ）和Ｕ２５１逡逑细胞（图３．８Ｄ和图３．８Ｆ）中ＳＮＲＰＦ的ｍＲＮＡ和蛋白水平的表达。逡逑２８逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

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本文编号：2607619