MiR-152-3p靶向调控DNMT1-NF2通路与胶质瘤细胞凋亡、侵袭机制的研究

发布时间：2020-04-01 15:54

【摘要】：背景:脑胶质瘤发生、发展存在复杂调控机制,如何攻克胶质瘤始终是研究热点及难点。目前胶质母细胞瘤患者平均中位生存期只有12～18月,既往研究NF2基因与肿瘤发病过程关系密切,是一个重要肿瘤抑制因子,NF2基因表达产物merlin蛋白在肿瘤细胞调控过程作用关键。DNMT对NF2基因甲基化进行催化,异常DNMT表达与肿瘤发生紧密联系,而大量破坏DNA甲基化正是胶质瘤细胞迅速增殖的特性。已有大量研究发现不同miRNAs因子失调与肿瘤发病机制之间密切相关,但miRNAs和DNMT1之间调控机制及与胶质瘤凋亡、侵袭关系仍有待研究。目的和意义:本课题围绕miR-152-3p与DNMT1-NF2通路之间的调控机制,研究这条通路对胶质瘤发生、发展及凋亡等生物学行为的影响。通过检测miR-152-3p、DNMT1、NF2及其甲基化在胶质母细胞瘤组织和胶质瘤细胞表达,分析miR-152-3p、DNMT1、NF2三者与胶质瘤细胞凋亡、侵袭细胞学之间关系的实验,探讨miR-152-3p、DNMT1、NF2与胶质瘤发病机制之间关系,寻找调控胶质瘤细胞凋亡及侵袭新的环路。方法:本课题研究分两部分内容:第一章qRT-PCR和Western blot检测胶质母细胞瘤组织和胶质瘤细胞miR-152-3p、DNMT1、NF2表达;免疫组化检测正常人脑组织和胶质母细胞瘤组织中DNMT1、merlin蛋白表达;MSP和BSP检测胶质母细胞瘤组织和不同胶质瘤细胞系中NF2基因甲基化程度。第二章DNMT1基因siRNA重组质粒与NF2过表达载体构建;将敲减DNMT1基因表达质粒及NF2、miR-152-3p过表达载体转染体外培养U251胶质瘤细胞;qRT-PCR、Westm blot、MSP和BSP检测转染后胶质瘤细胞miR-152-3p、DNMT1、NF2表达;CCK方法检测质粒转染后U251胶质瘤细胞增殖情况;免疫荧光实验对CCK结果进行验证;流式细胞学方法、EDU方法检测质粒转染后U251胶质瘤细胞凋亡情况;评估transwell侵袭实验转染后U251胶质瘤细胞情况;双荧光素酶实验对miR-152-3p的靶点进行验证。结果:NF2甲基化引起DNMT1在胶质瘤母细胞瘤组织和U251、U87、T98-G、A172胶质瘤细胞系表达明显增加。敲低DNMT1mRNA表达引起NF2去甲基化,提高NF2转录及翻译水平表达。实验发现miR-152-3p在胶质母细胞瘤组织表达明显减少,miR-152-3p直接靶向调节DNMT1,两者潜在结合位点是DNMT13'-UTR的48～55位置。而且我们发现miR-152-3p、NF2过表达和敲低DNMT1显著诱导胶质瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞侵袭活力。MiR-152-3p通过减少DNMT1表达抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭活性。结论:1.胶质瘤发病过程DNMT1和miR-152-3p组成一个负反馈环,NF2和miR-152-3p形成一个正反馈环,miRNA在调控通路起肿瘤抑制因子作用。2.MiR-152-3p通过减少DNMT1表达抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭活性。3.MiR-152-3p作为一个新型提升胶质瘤细胞侵袭能力的调节因子和希望为胶质瘤治疗提供一个新的治疗途径。
【图文】：

逡逑瘤是否存在联系。图１－１Ｃ中ｑＲＴ－ＰＣＲ检测这２０对胶质母细胞瘤及正常脑组织逡逑标本中ｍｉＲ－１５２－３ｐ的表达，，正常脑组织标本ｍｉＲ－１５２－３ｐ的表达明显高于胶质逡逑母细胞瘤标本表达，我们推测ｍｉＲ－１５２－３ｐ可能对胶质瘤生长起抑制作用。逡逑表邋１－１：邋ｍｉＲ－１５２－３ｐ、ＤＮＭＴ１、ＮＦ２ｍＲＮＡ邋在脑和邋ＧＢＭ邋组织表达（又土Ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋：邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＮＦ２，邋ＤＮＭＴ１邋ａｎｄ邋ｍｉＲ－１５２－３ｐ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｂｒａｉｎ邋ａｎｄ邋ＧＢＭ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逡逑（Ｘ±Ｓ）逡逑基因表达逦平均值逦ＳＤ值逦Ｐ逡逑脑组织组ＮＦ２逦０．９３逦０．２３逡逑＜０．０１逡逑ＧＢＭ邋组邋ＮＦ２逦０．４０逦０．１５逡逑脑组织组邋ＤＮＭＴ１逦１．０８逦０．３４逡逑＜０．０１逡逑ＧＢＭ邋组邋ＤＮＭＴ１逦３．７６逦１．２６逡逑脑组织组邋ｍｉＲ－１５２－３ｐ逦１．０５逦０．１８逡逑＜０．０１逡逑ＧＢＭ邋组邋ｍｉＲ－１５２－３ｐ逦０．４１逦０．１４逡逑Ａ邋２（Ｈ逦ＮＦ２逦？邋８逦ＤＮＭＴ１逦＾逦ｍｉＲ－１５２－３ｐ逡逑ｇ邋１逦＇￣＾￣￣逦｜逦＊￣＾￣；逦｜逦唯逡逑ｒ邋ｔ邋ｎ邋ｉ邋＾逡逑０．０－＊逦１逦Ｊ逦邋逦１逦ｊ逦邋0．0ｔ逦？逦逡逑Ｎ逦Ｇ逦Ｎ逦Ｇ逦Ｎ逦Ｇ逡逑图１－ｈ邋Ｎ为正常脑组织，Ｇ为胶质母细胞瘤组织。ｑＲＴ－ＰＣＲ检测正常脑组织和胶质母细逡逑胞瘤组织ｈａｓ－ｍｉＲ－１５２－３ｐ邋（Ａ）、ＤＮＭＴ１邋（Ｂ）、ＮＦ２邋（Ｃ）的ｒｎＲＮＡ表达

图１－２Ｂ：免疫印迹检测在ＨＥＢ邋（正常）、Ｕ２５１、Ｕ８７、Ｔ９８－Ｇ、Ａ１７２胶质瘤细胞中ＤＮＭＴｌ逡逑蛋白和Ｍｅｒｌｉｎ蛋白水平。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋ｌ－２Ｂ：Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋ＨＥＢ，邋Ｕ２５１，邋Ｕ８７，邋ＴＧ－Ｇ邋ａｎｄ邋Ａ１７２邋ｗｅｒｅ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｄｅｔｅｃｔ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑３０逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

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本文编号：2610660