tBHQ与过氧化物还原酶2在亚铁离子导致的神经损伤中的作用机制研究

发布时间：2020-04-10 07:55

【摘要】：研究背景铁是中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)维持正常生理功能所必需的元素,其在氧的转运、DNA合成、髓鞘形成、线粒体呼吸作用和神经递质生成中均具有重要作用。然而,细胞内游离的亚铁离子可与内源性的过氧化氢反应生成反应性活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS),因此,神经细胞内亚铁离子的沉积可导致氧化应激(Oxidative Stress,OS)与炎症反应,进而造成神经损伤。由此可见神经细胞内的铁稳态是CNS维持正常生理功能的必要条件。先前的研究发现:在脑出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)、脑缺血、创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)及阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Diseas,AD)、帕金森病(Parkinson's Disease,PD)、亨廷顿病(Huntington's Disease,HD)等多种神经退行性疾病患者的脑内均存在铁的过量沉积,提示亚铁离子导致的神经损伤在这些疾病的发生发展过程中具有重要作用。叔丁基氢醌(Tert-Butylhydroquinone,tBHQ)是常用的食品抗氧化剂—丁基羟基茴香醚的一种代谢物,研究表明tBHQ能激活NF-E2相关因子2/抗氧化反应原件(NF-E2-Related Factor2/Antioxidant Response Element,Nrf2/ARE)通路。该通路是细胞维持自身氧化还原稳态的关键通路,生理状态下,Kelch-Like ECH-AssociatedProtein-1(Keap1)蛋白将Nrf2固定于细胞质中,同时还会诱导Nrf2的泛素化,泛素化的Nrf2会被迅速降解,从而将Nrf2/ARE通路的活性维持在生理水平。在发生OS时,Keap1的构象会发生改变,使其失去对Nrf2的泛素化作用,从而使Nrf2免于泛素化降解,新合成的Nrf2在胞质内聚集,并能够转位至细胞核中,细胞核内的Nrf2与ARE结合,进而促进血红素氧化酶1(Heme Oxygenase-1,Hmox-1)、谷胱甘肽转移酶(Glutathione Transferases,GSTs)、谷胱甘肽过氧化物酶1(Glutathione Peroxidase-1,Gpx1)和NAD(P)H醌氧化还原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase-1,Nqo1]等多种抗氧化酶的表达。tBHQ可改变Keap1-Nrf2复合物的构象,抑制Keap1介导的Nrf2泛素化,从而提高Nrf2的稳定性。tBHQ在多种神经系统疾病模型中均具有保护作用,此外,tBHQ已经获批可应用于人类。但tBHQ在亚铁离子导致的神经损伤中的作用仍有待深入研究。过氧化物还原酶(Peroxiredoxin,Prdx)家族隶属于硫氧还原蛋白系统,是一类巯基过氧化物酶。其可通过清除细胞内的过氧化物从而发挥抗氧化的作用,此外,Prdx还能在多种炎性疾病中发挥抗炎作用。哺乳动物的Prdx家族包括6个成员,分别命名为Prdx1-6,其中Prdx2在CNS内含量最为丰富,这使其成为Prdx家族在脑内发挥抗氧化作用的主要成员。已有研究证实Prdx2能够在脑缺血、AD和PD中发挥保护作用,但Prdx2在亚铁离子导致的神经损伤中的作用仍不清楚。PC12细胞在形态、生理和生化等方面具有神经元的特性,因而被广泛用于神经生理、神经毒理、神经保护和神经认知等方面的体外研究。已有研究证实亚铁离子溶液能够诱导PC12细胞发生脂质过氧化和细胞死亡。因此,在本课题中,我们使用硫酸亚铁(Ferrous Sulfate,FS)刺激的PC12细胞作为研究亚铁离子神经损伤的体外模型。本课题包括两部分,第一部分:使用FS刺激tBHQ预处理的PC12细胞,研究tBHQ对细胞损伤和凋亡的作用及其机制,随后,向大鼠纹状体内立体定向注射FS溶液来构建亚铁离子神经损伤动物模型,从而在体内水平研究tBHQ对于亚铁离子神经损伤的作用;第二部分:首先检测FS对于PC12细胞中Prdx2表达的影响,然后在FS处理前,使用慢病毒敲低PC12细胞中Prdx2的含量,进而研究Prdx2在亚铁离子导致的神经损伤中的作用。期望通过以上研究,为脑卒中、TBI、神经退行性疾病等多种伴有铁沉积的CNS疾病提供新的治疗靶点。第一部分:tBHQ在亚铁离子导致的神经损伤中的作用机制研究目的:在体内、体外水平研究tBHQ能否改善亚铁离子导致神经损伤;使用体外实验研究tBHQ的神经保护作用是否依赖于Nrf2/ARE通路。方法:1.细胞培养:大鼠PC12细胞系,给予含有10%马血清和5%胎牛血清的DMEM培养基作常规培养。2.FS作用浓度与作用时间的确定:使用不同浓度(1 μ mol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μ mol/L、20 μ mol/L)的FS溶液刺激PC12细胞24h,然后使用CCK-8实验检测细胞活力,选择将细胞活力降低50%以上的最低浓度作为后续实验的刺激浓度,然后使用该浓度刺激PC12细胞不同的时间(3h、6h、12h、24h、36h),使用CCK-8检测细胞活力,然后根据结果选择最适的作用时间。3.细胞实验分组:在明确了 FS的最适作用浓度与时间后,按不同的处理方式,将细胞分为Ctrl组、tBHQ处理组(40 μmol/L tBHQ作用40h)、FS刺激组(10μmol/L FS 处理 24h)和 tBHQ+FS 组(40 μmol/L tBHQ 预处理 16h,再给予 40 μmol/LtBHQ 和 10 μmol/LFS 刺激 24h)。4.检测细胞内亚铁离子的含量:刺激完成后,将各组细胞裂解,先使用BCA法检测各组的蛋白浓度,然后使用菲洛嗪法检测裂解液中亚铁离子的浓度。5.细胞损伤和细胞凋亡检测:分别使用乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)释放实验和流式细胞凋亡检测来衡量PC12细胞的损伤和凋亡情况。6.凋亡相关蛋白的检测:使用Western Blot检测PC12细胞内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cytochrome C 和 Cleaved Caspase-3 的表达。7.OS相关指标的检测:使用2',7'-Dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)染色测量细胞内ROS的含量;检测细胞内丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和γ-Histone H2A.X的水平来分别衡量PC12细胞内脂质过氧化和DNA氧化损伤的程度。8.炎症反应相关指标的检测:使用Western Blot检测细胞核蛋白中核因子Kappa B p65(Nuclear Factor Kappa B p65,NF-κB p65)及细胞总蛋白中 I kappa B a(IκBa)和环氧合酶 2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的含量;使用 ELISA检测细胞上清中肿瘤坏死因子a(Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a)和白细胞介素 1 β(Interleukin-1β,IL-1β)的水平。9.Nrf2蛋白核转位与基因转录的检测:使用Western Blot检测胞核、胞浆蛋白中Nrf2的含量;使用qRT-PCR检测各组细胞中Nrf2 mRNA的水平。10.检测Nrf2下游蛋白的表达情况:使用Western Blot检测Nrf2下游蛋白Hmox-1、Nqo1 和 Gpx1 的表达。11.检测tBHQ的保护作用是否依赖于Nrf2/ARE通路:向PC12细胞内转染Nrf2 siRNA,使用Western Blot检测Nrf2 siRNA的转染效率,之后使用LDH释放实验观察敲低Nrf2能否消除tBHQ的保护作用。12.实验动物分组:按不同的处理方式,将Wistar大鼠随机分为Sham组、tBHQ处理组、FS损伤组和tBHQ+FS组;对于tBHQ处理组和tBHQ+FS组,在颅内立体定向注射前24h,按照3.33mL/kg的剂量,向大鼠腹腔内注射含30mmol/LtBHQ的生理盐水,每8h一次,共三次;而对于Sham组和FS损伤组,则按照同样的方式注射等量的不含tBHQ的生理盐水。13.动物模型的构建:颅内立体定向注射在首次腹腔注射后24h进行,向FS损伤组和tBHQ+FS组大鼠右侧纹状体内注射10 μ L含1mmol/L FS的生理盐水;而对于Sham组和tBHQ处理组,则以同样的方式注射等量不含FS的生理盐水。14.检测腹腔注射tBHQ对大鼠纹状体内Nrf2基因转录和蛋白核转位的影响:提取Sham组和tBHQ处理组大鼠右侧纹状体内的胞核、胞浆蛋白及总RNA,使用Western Blot检测胞核、胞浆蛋白中Nrf2的含量,使用qRT-PCR检测Nrf2 mRNA的水平。15.大鼠纹状体内脂质过氧化和炎症反应相关指标的检测:使用ELISA检测纹状体内4-羟基壬烯酸(4-Hydroxynonenal,4-HNE)的含量;使用免疫组化检测大鼠纹状体内 NF-κ B p65 和 Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule 1(Iba1)的表达。16.大鼠纹状体内细胞凋亡及损伤体积的检测:使用TUNEL染色检测纹状体内的细胞凋亡;对于损伤体积的检测,将固定好的鼠脑置于脑切片模具上,沿注射针孔所在冠状平面将脑切开,然后在此平面前后每隔2mm做连续冠状切,直到切面上无损伤为止,将每个平面进行拍照,使用ImageJ计算出每个切面上损伤的面积,求和,然后乘以前后两张切片的距离,即得损伤体积。17.大鼠神经功能障碍的检测:使用24分制的神经功能评分量表进行神经功能障碍检测。结果:1.FS作用浓度与时间的确定:FS的作用浓度越高,PC12细胞的活力就下降得越明显,10 μ mol/L FS作用24h可将细胞活力下降55%;在10 μ mol/L FS刺激PC12的24h小时内,细胞活力迅速下降,但在24-36h,细胞活力的降幅明显减小。于是我们在后续实验中使用10 μ mol/L的FS处理细胞24h。2.FS可以显著升高PC12细胞内亚铁离子的浓度:菲洛嗪法显示10 mol/LFS溶液作用24h可将PC12细胞内亚铁离子的浓度升高10倍以上。而tBHQ对FS刺激的PC12细胞内的亚铁离子浓度无明显影响。3.tBHQ可抑制FS导致的PC12细胞损伤和凋亡:FS可升高培养基中LDH的含量,而tBHQ可抑制FS的这一效应;FS能将PC12细胞的凋亡率由3.75%升至13.30%,而tBHQ预处理则可将凋亡率降至9.08%。4.tBHQ可抑制FS导致的PC12细胞中凋亡相关蛋白的表达升高:FS可升高PC12细胞中Bax的表达,同时降低Bcl-2的表达,从而升高Bax/Bcl-2表达比,此外,FS还能升高Cytochrome C和Cleaved Caspase-3的表达;tBHQ预处理可抑制 FS 导致的 Bax/Bcl-2 表达比升高,以及 Cytochrome C 和 Cleaved Caspase-3的表达升高。5.tBHQ可抑制FS导致的PC12细胞内的OS:DCFH-DA染色显示tBHQ可抑制FS导致的ROS产生;此外,tBHQ可抑制FS导致的MDA和γ-Histone H2A.X含量的升高,表明tBHQ可缓解FS导致的脂质过氧化和DNA氧化损伤。6.tBHQ可抑制FS导致的PC12细胞内的炎症反应:通过检测PC12细胞胞核蛋白中NF-κ B p65的含量来评估其核转位情况,FS可升高细胞核蛋白中NF-κ B p65的水平,并促进IKBa的磷酸化,而tBHQ则可抑制FS诱导的NF-κB p65核转位和I κ B a的磷酸化;PC12细胞中COX-2、TNF-α、IL-1 β的表达在FS处理后均显著升高,而tBHQ则可抑制这一效应。7.tBHQ促进PC12细胞中Nrf2核转位,但会减弱FS对Nrf2转录及表达的促进作用:tBHQ单独作用能升高胞核蛋白中Nrf2的水平,同时降低胞浆蛋白中Nrf2的含量;FS单独作用能同时升高胞核与胞浆蛋白中Nrf2的含量,但tBHQ预处理能够抑制这一现象。qRT-PCR结果显示tBHQ单独作用对Nrf2的转录无明显影响,而FS可以明显升高Nrf2 mRNA水平,但这一效应可被tBHQ预处理所抑制。8.tBHQ促进PC12细胞中Nrf2下游蛋白的表达,但会减弱FS对这些蛋白表达的促进作用:tBHQ单独作用能促进Nrf2下游蛋白Hmox-1、Nqo1和Gpx1的表达,而FS单独作用可更明显地升高这三者的水平,但tBHQ预处理则会抑制FS导致的Hmox-1、Nqo1和Gpx1的表达升高。9.tBHQ对FS刺激的PC12细胞的保护作用是依赖于Nrf2/ARE通路的:向PC12细胞中转染Nrf2 siRNA,Western Blot和qRT-PCR结果显示Nrf2 siRNA能明显降低PC12细胞中Nrf2蛋白和mRNA的水平;LDH释放实验显示:对于转染了 Ctrl siRNA和Nrf2 siRNA的PC12细胞,FS对后者的损伤作用更强,表明Nrf2/ARE通路在PC12细胞抵御亚铁离子毒性的过程中具有重要作用;此外,Nrf2 siRNA能够消除tBHQ对PC12细胞的保护作用,这一结果表明tBHQ对FS刺激的PC12细胞的保护作用是依赖于Nrf2/ARE通路的。10.tBHQ腹腔注射能促进大鼠纹状体内Nrf2的核转位,但对Nrf2的基因转录无明显影响:Western Blot显示tBHQ能升高大鼠纹状体内细胞细胞核中Nrf2的含量,同时降低细胞质中Nrf2的水平;qRT-PCR结果显示tBHQ对大鼠纹状体内Nrf2 mRNA的水平无明显影响。11.tBHQ腹腔注射能缓解FS导致的大鼠纹状体内的OS及炎症反应:颅内注射FS能显著升高纹状体内脂质过氧化副产物-4-HNE的水平,而tBHQ则可抑制FS导致的4-HNE的升高;免疫组化显示颅内注射FS能促进NF-κ B和小胶质细胞的活化,而这一现象能够被tBHQ腹腔注射所抑制。12.tBHQ腹腔注射能改善FS导致的纹状体内的细胞凋亡和大鼠神经功能障碍,但对损伤体积无明显影响:相比于FS损伤组,tBHQ+FS组的TUNEL阳性细胞比率和神经功能障碍评分明显降低;但两组的损伤体积无明显差异。结论:1.亚铁离子刺激可引起神经氧化及炎性损伤,进而导致神经细胞凋亡。2.tBHQ可改善亚铁离子导致的神经氧化及炎性损伤,并能减少细胞凋亡,改善神经功能障碍,从而发挥神经保护作用。3.tBHQ的神经保护作用是依赖于Nrf2/ARE通路的。第二部分过氧化物还原酶2在亚铁离子导致的神经损伤中的作用机制研究目的:研究PC12细胞内的Prdx2在亚铁离子刺激后的变化情况,同时探究敲低PC12细胞内的Prdx2对于亚铁离子导致的OS、炎症反应、细胞损伤和凋亡的影响。方法:1.检测FS对PC12细胞内Prdx2表达的影响:使用免疫荧光和Western Blot检测PC12细胞内Prdx2蛋白的表达,使用qRT-PCR检测PC12细胞内Prdx2 mRNA的水平。2.稳定表达Prdx2 shRNA的PC12细胞株的建立:向PC12细胞转染表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)和 Prdx2 shRNA 或 Ctrl shRNA 的慢病毒,转染24h后,将细胞稀释10倍,进行传代,待细胞贴壁后,使用1μ g/mL的嘌呤霉素进行筛选,一周后即可得到Prdx2 shRNA稳转株,观察稳转株中GFP的表达,并应用qRT-PCR和Western Blot分别检测Prdx2 mRNA和蛋白的水平。3.细胞实验分组:将细胞实验分为4组,即Ctr1组,FS刺激组(10 μ mol/L FS刺激 PC12 细胞 24h),FS+Prdx2c 组(10μmol/L FS 刺激稳定表达 Ctrl shRNA的 PC12 细胞 24h),FS+Prdx2i 组(10μmol/L FS 刺激稳定表达 Prdx2 shRNA的PC12细胞24h)。4.细胞内亚铁离子浓度的检测:我们使用菲洛嗪法检测各组细胞内亚铁离子的浓度,以此来明确敲低Prdx2是否会影响FS刺激的PC12细胞内的亚铁离子含量。5.细胞损伤和凋亡的检测:分别用LDH释放实验和流式凋亡检测来衡量PC12细胞损伤和凋亡的情况。6.凋亡相关蛋白的检测:使用Western Blot检测PC12细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome C 和 Cleaved Caspase-3 的表达。7.OS相关指标的检测:使用免疫荧光检测3'-Nitrotyrosine来衡量蛋白质氧化的程度;测量细胞内MDA的含量来评估脂质氧化的程度;使用Western Blot检测γ-Histone H2A.X的表达来衡量DNA氧化损伤的程度。8.炎症反应相关指标的检测:使用Western Blot检测细胞核中NF-κ B p65的含量,以及总蛋白中COX-2的水平;使用ELISA检测细胞上清中TNF-a和IL-1 β的含量。结果:1.FS可促进PC12细胞中Prdx2的转录和表达:FS刺激后,PC12细胞中Prdx2 mRNA和蛋白的水平明显升高。2.在稳定表达Prdx2 shRNA的PC12细胞中,Prdx2的转录和表达受到显著的抑制:在稳转株中,几乎所有的细胞均表达GFP,并且Prdx2mRNA和蛋白的水平明显降低。3.敲低Prdx2不会影响FS刺激的PC12细胞内的亚铁离子浓度:菲洛嗪法显示FS刺激可显著升高PC12细胞内的亚铁离子浓度,而敲低Prdx2对FS的这一作用无明显影响。4.敲低PC12细胞中的Prdx2可加重FS导致细胞损伤和凋亡:敲低Prdx2可进一步促进FS导致的LDH释放;流式凋亡检测显示FS可将PC12细胞的凋亡率由0.81%升至11.68%,而敲低Prdx2可将凋亡率进一步上升至19.21%。5.敲低PC12细胞中的Prdx2可进一步促进FS导致的凋亡相关蛋白的表达升高:FS 可升高 Bax/Bcl-2 表达比,以及 Cytochrome C 和 Cleaved Caspase-3 的表达,敲低Prdx2可进一步促进上述现象。6.敲低PC12细胞中的Prdx2可加重FS导致的OS:FS刺激后,PC12细胞中3'-Nitrotyrosine、MDA和γ-HistoneH2A.X的含量明显升高,表明FS可导致PC12细胞内的蛋白质氧化、脂质过氧化和DNA氧化损伤;而敲低Prdx2可进一步促进这三者的升高。7.敲低PC12细胞中的Prdx2可加重FS导致的炎症反应:敲低Prdx2进一步促进FS导致的NF-κ B p65核转位以及COX-2、TNF-a和IL-1 β的表达升高。结论:1.亚铁离子可促进PC12细胞中Prdx2的转录和表达。2.敲低PC12细胞中的Prdx2可通过加剧OS和炎症反应进一步加重亚铁离子导致的细胞损伤与凋亡,表明Prdx2在抵御亚铁离子导致的神经损伤的过程中具有重要作用。
【图文】：

图１．邋ＦＳ作用浓度与作用时间的确定。逡逑（Ａ）邋ＰＣ１２邋细胞经不同浓度（ｌｕｍｏｌ／Ｌ、２ｙｍｏｌ／Ｌ、５ｕｍｏｌ／Ｌ、ｌ0ｙｍｏｌ／Ｌ、逡逑２０邋ｕ邋ｍｏｌ／Ｌ）的ＦＳ处理２４ｈ后，使用ＣＣＫ－８检测细胞活力。（Ｂ）使用１０邋ｙ邋ｍｏｌ／Ｌ逡逑－

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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741

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本文编号：2621963