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Cdk5抑制肽改善p25神经毒性导致的小鼠神经退行性变化

发布时间:2020-04-11 14:06
【摘要】:研究背景:p35经蛋白酶calpain裂解产生N-端p10和C-端p25。相比于p35,p25半衰期更长、细胞内活动范围更广、与Cdk5结合更紧密,因而p25更易于结合和活化Cdk5、导致Cdk5下游的关键底物过度磷酸化,进而导致神经退行性疾病的发生。CIP是p35的截短片段。在体内外实验中发现,CIP能特异性地抑制Cdk5/p25复合物的活性。前期研究中,我们证实了使用AAV9介导CIP干预APP/PS1模型鼠能有效改善小鼠的记忆衰退及焦虑样行为,并减少Tau蛋白磷酸化、Aβ沉淀的产生。我们在MPTP/p诱导的帕金森病模型鼠上进行的研究也进一步证实了 AAV9-CIP能有效减少小鼠神经元丢失和改善运动及焦虑样症状。研究目的:1.建立以AAV8-GFP-p25诱导的p25过表达模型鼠;2.观察这些p25过表达模型鼠的病理变化和行为变化特点;3.分组实验观察AAV9-CIP能否改善AAV8-GFP-p25诱导的p25过表达模型鼠的病理改变;4.进行行为学实验,通过实验结果分析AAV9-CIP改善AAV8-GFP-p25诱导的p25过表达模型鼠的异常行为的效果。研究方法:1.使用相应的质粒来构建AAV病毒载体及相应的病毒包装;2.在小鼠8周龄时,AAV8-GFP-p25鼠脑侧脑室注射方案进行p25过表达模型鼠构建;3.在AAV8-GFP-p25注射后1月,进行AAV9-CIP鼠脑同侧侧脑室注射干预处理;4.在小鼠6月龄时,行为学检测分析各组小鼠行为学变化特点;5.通过Western blot及鼠脑组织切片行免疫组化分析分别观察AAV8-GFP-p25模型鼠、AAV9-CIP干预鼠的相应的蛋白表达水平变化和病理变化;6.统计学分析:研究中所有的数据都使用了SPSS20.0、Image J和GraphPad Prism 6.05统计分析软件来进行统计。除主动回避反应实验使用重复测量分析方法以外,其他数据使用组间单因素分析方法。各组数据以平均值±标准误的形式在统计图中呈现,当P值0.05时,可认为有统计学意义。研究结果:1.在AAV8-GFP-p25诱导的p25过表达模型鼠中发现,小鼠脑组织中出现Tau蛋白多个位点上的过磷酸化现象,并且伴有星形胶质细胞的活化和炎性因子白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α表达水平的增高;2.行为学实验显示,AAV8-GFP-p25诱导的p25过表达模型鼠可表现出明显的学习能力的下降和焦虑样行为;3.经AAV9-CIP侧脑室注射干预处理的p25过表达模型鼠可观察到上述病理现象的改善和炎性因子的表达减少,并且能缓解小鼠学习能力的衰退。结论:1.AAV8-GFP-p25可以诱导以学习能力衰退和焦虑样行为为主要行为特点的p25过表达模型鼠。2.通过AAV8-GFP-p25诱导的模型鼠将更易于建立,节省时间和资金。重要的是在小鼠成年后在p25导致神经毒性后再进行CIP治疗,更加能模拟临床的实际情况。3.AAV9-CIP的干预处理能有效减少此p25过表达模型鼠病理现象的发生及炎性现象产生,也能有效缓解其学习能力的衰退现象。这些结果表明AAV病毒介导的CIP能有效靶向抑制p25的神经毒性。
【图文】:

蛋白磷酸化,月龄,裂解液,脑组织


导的p25过表达鼠中也发现了邋Tau蛋白的Serl99,Ser202/Thr205和Thr231逡逑位点上存在过磷酸化现象[S7'邋S8:。因此在本实验中也对这三个磷酸化位点进行了逡逑Western邋blot检测。如图3-3-2.邋B所示通过侧脑室注射AAV8-GFP-p25病毒的小逡逑鼠鼠脑组织中的Tau蛋白在Serl99,邋Ser202/Thr205邋(用AT-8抗体检测)和逡逑Thr231(用AT180抗体检测)位点上的磷酸化程度明显增加。而在进行了邋AAV9-CIP逡逑34逡逑

小鼠,神经炎,月龄,组织切片


图3-3.邋AAV9-CIP的干预处理能够抑制p25介导的神经炎症发生逡逑图中所有的脑组织裂解液和组织切片都在小鼠6月龄时取材制作的逡逑A图和B图中在小鼠海马区的GFAP免疫组化染色。p25/vector组小鼠比对照组显示出逡逑了更高的邋GFAP邋含量(40.邋82邋±邋1.499邋vs.邋26.邋44邋±邋2.邋337,,p=0.邋002);并且这种邋GFAP逡逑38逡逑
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R741

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本文编号:2623678

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