土贝母苷甲1对胶质母细胞瘤细胞增殖和迁移的影响及其机制研究

发布时间：2020-04-15 00:00

【摘要】：胶质瘤是大脑最常见的原发性肿瘤,其中胶质母细胞瘤(GBM,4级胶质瘤)是最具侵袭性的的一种,目前几乎没有有效的治疗方法[1-4]。在先前的研究中发现间质表皮转化因子(MET),在胶质母细胞瘤中行使着重要的功能,在许多胶质瘤患者中都出现了MET过度激活和基因的扩增[5]。因此,针对MET的靶向治疗日渐火热并且有很多靶向MET基因的药物已经进入了临床试验或已经在临床上开始使用,一部分药物取得了一定的效果[6]。在中国,中药一直作为我们疾病治疗的药物中非常重要的一员。然而由于很多中药缺乏机制的研究因此在国际上缺乏认同。因此,对于中药药理机制的研究能够为中药推广提供重要的科学依据。癌症作为当代世界的一大医学难题一直威胁着人类的生命健康。据报道,而由传统中药土贝母块茎所提取的中药单体土贝母苷甲1在胶质瘤中能够发挥其抗癌活性,但是其具体相关机制并不完善。因此,通过本课题的研究能够进一步完善其抗癌作用的具体机制。并且为胶质瘤的治疗提供一条潜在的途径。本课题的主要发现如下:1.土贝母苷甲1影响胶质母细胞瘤细胞的增殖我们通过查阅先前的研究文献[7],获得药物处理LN229以及U87细胞的适宜浓度。随后设计所对应的浓度区间对LN229和U87细胞进行处理。通过显微镜对处理24h后的细胞观察。结果发现,LN229和U87细胞的数量随着浓度的增高显著减少。为了进一步探究土贝母苷甲1对胶质母细胞瘤增殖的影响。我们利用MTT实验测得了以上两种细胞系的生存曲线。其结果与上述结果一致。通过以上实验结果,我们发现土贝母苷甲1能够随浓度梯度的上升抑制胶质母细胞瘤的增殖。2.土贝母苷甲1对胶质母细胞瘤细胞周期的影响药物对细胞增殖的抑制往往体现在对细胞周期的抑制上。因此,我们利用BrdU滞留实验检测土贝母苷甲1对胶质母瘤细胞瘤细胞DNA复制的影响。结果表明,添加土贝母苷甲1后能够抑制细胞的DNA复制,随后通过流式细胞分析和Western Blot实验,发现土贝母苷甲1能够使LN229和U87细胞周期阻滞在G2/M期。通过以上结果发现土贝母苷甲1能够使胶质母细胞瘤细胞阻滞在G2/M期,从而抑制细胞增殖。3.土贝母苷甲1对胶质母细胞瘤细胞增殖迁移的影响胶质母细胞瘤其一大特点就是具有很强的转移能力[8]。因此,我们通过划痕愈合实验,以及Transwell实验对加药处理后LN229和U87细胞迁移能力和侵袭能力进行了检测。结果发现,经过土贝母苷甲1处理后,胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭能力受到了显著的抑制,随后利用Western Blot实验对调节细胞的重要蛋白MMP-7,MMP-2,Snail和Slug进行了检测。发现土贝母苷甲1能够显著下调上述蛋白的表达。通过以上结果分析,土贝母苷甲1能够抑制迁移侵袭相关蛋白的表达从而抑制细胞的迁移侵袭能力。4.土贝母苷甲1对MET以及其重要下游通路的影响为了进一步探究土贝母苷甲1对胶质母细胞瘤细胞增殖迁移影响的相关机制。我们利用Western Blot实验对相关通路的重要蛋白进行了检测。结果表明,土贝母苷甲1能够显著抑制AKT,ERK蛋白的磷酸化水平并且抑制MET的蛋白水平。MET作为一种重要的络氨酸受体激酶,其水平的降低能够显著抑制其下游相关通路的活性,因此我们采用过表达技术,在LN229和U87细胞进行MET的过表达,在用药物进行处理。结果发现,过表达MET的上述细胞系能够显著减弱土贝母苷甲对细胞的增殖迁移的抑制。并且,AKT,ERK蛋白的磷酸化水平也有明显的回复。为了探究土贝母苷甲1降低MET蛋白水平的相关机制,我们运用了荧光定量PCR技术以及IP实验。结果发现,MET蛋白水平的降低是由土贝母苷甲1所诱导的MET泛素化水平增高所引起。综合上述实验结果我们发现,土贝母苷甲1能够通过增加MET的泛素化水平从而下调其蛋白水平,最终影响MET下游通路的活性抑制胶质母瘤细胞的增殖迁移能力。5.土贝母苷甲1对胶质母细胞瘤细胞小鼠皮下成瘤能力的影响。为了进一步验证土贝母苷甲1的抗肿瘤活性,我们设计了小鼠皮下成瘤实验。通过实验结果我们发现,土贝母苷甲1能够显著抑制小鼠皮下肿瘤的生长。并且,通过免疫组化实验分析土贝母苷甲能够在小鼠体内显著抑制肿瘤生长标志物Ki-67的表达,而对MET蛋白水平的抑制也在体内实验得到了证明。通过以上结果我们发现,土贝母苷甲1在小鼠体内也具有明显的抗肿瘤活性。综上所述,土贝母苷甲1能够通过诱导MET的泛素化降解抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖,迁移能力。并且,能够在小鼠体内皮下肿瘤中也能够靶向MET,进而行使其抗肿瘤活性。通过本课题的研究对土贝母苷甲1的抗肿瘤活性机制进行了进一步的阐释,能够为在胶质母细胞瘤的靶向MET的治疗方法提供一条新的潜在途径。
【图文】：

示意图,激活机制,生理条件,示意图

其中最为常见的就是癌症的发生。借助于基因组时临床实践中下一代测序（NGS）的实施，几乎所有2]。通过遗传图谱的分析，我们发现在肿瘤中存在着包括 EGFR, HER2/ErbB2, MET 等。而这些重要基疗提供了新的思路。因此，对于癌症细胞中 RTK 功件下 RTK 的激活机制RTK 的激活依赖其特定的配体。当特异性配体与 R。RTK 活性被激活从而行使其相关功能[13]（图 1过与配体结合所产生的构象变化使得酪氨酸激酶区身抑制[14]。这种构象变化也能够使得酪氨酸激酶区募集和激活多种下游信号蛋白，其中包括 Src 同源（PTB）结构域。这些结构域与受体内的特定磷酸关键细胞信号传导途径的下游通路中[14]。

示意图,土贝母苷甲,化学结构,示意图

的信息交流主要通过由分泌细胞分泌如生长因子等信号分完成。而细胞的自分泌针对的是细胞能够自行分泌这些信40]。如果细胞持续地进行自分泌那么则会导致细胞克隆增而这种自分泌现象在多种癌症中都已有了十分透彻的研究FR[42]、HGF-MET[43, 44]以及 SCF-KIT[45-47]自分泌循环能够与其他自分泌生长通路协同参与到肿瘤的发生发展过通路很可能成为又一个癌症治疗的重要靶点[42]。母苷甲抗肿瘤研究进展直以来都是我们国家医药文化的一笔重要的财富。在我国药可以说是经受住了历史的考验。为我国人民的疾病治疗。而其中，，有些中药在肿瘤的治疗过程中也展示出了其独究的土贝母苷甲 1（图 1.2）就是由干燥的土贝母块茎中所活性中药单体。除此之外，得率高的还有土贝母苷甲 2 以
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.41

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