癫痫发作后海马神经元Parthanatos死亡机制的研究

发布时间：2020-04-15 08:23

【摘要】：本研究分为三部分进行实验:实验一:谷氨酸诱导HT22细胞发生Parthanatos死亡机制的研究目的:多聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)依赖的细胞死亡,也称为Parthanatos死亡,是一种新的独特的细胞死亡方式,在癫痫研究领域中却鲜有报道。本部分研究拟在癫痫体外模型中探讨Parthanatos死亡是否存在于癫痫诱导的神经元损伤机制中,为癫痫的神经保护治疗提供新的靶点。方法:体外培养小鼠海马神经元细胞系HT22细胞,使用CCK8法检测GLU的不同浓度以及不同作用时间对HT22细胞损伤情况,以选取最理想的细胞损伤模型。利用PARP-1抑制剂PJ34和si RNA沉默PARP-1基因技术对GLU诱导的HT22细胞损伤进行干预,使用LDH释放试验、Western blot、免疫荧光、流式细胞术等技术观察相关指标,探讨其作用机制。结果:(1)GLU诱导HT22细胞发生损伤呈浓度和时间依赖性,随着GLU作用时间的延长,细胞死亡率呈递增趋势(p0.01),细胞线粒体的膜电位进行性下降(p0.01),细胞内PARP-1表达升高,PAR的合成增多,线粒体AIF发生核转位增加;(2)与GLU作用HT22细胞12h和24h的死亡率相比,相应的PJ34预处理均可明显降低细胞的死亡率(12h,p0.05;24h,p0.01)。与此同时,PJ34的应用可明显降低GLU诱导的HT22细胞内PARP-1的表达和PAR的合成,并减少线粒体AIF向核转位。PJ34还可以减轻GLU诱导的HT22细胞内线粒体膜电位的下降(p0.01);(3)si RNA沉默PARP-1基因后,可明显减少GLU诱导的HT22细胞死亡(p0.01),并降低细胞内PARP-1的表达和PAR的合成,减少线粒体AIF向核发生转位,还会减轻GLU诱导的HT22细胞内线粒体膜电位的下降(p0.01)。结论:(1)GLU诱导HT22细胞发生死亡呈浓度和时间依赖性;(2)GLU诱导的HT22细胞死亡存在Parthanatos死亡机制;(3)PARP-1可以作为神经保护治疗的潜在干预靶点。实验二:氧化应激在谷氨酸诱导HT22细胞发生Parthanatos死亡中的作用目的:探讨谷氨酸诱导HT22产生的ROS与Parthanatos死亡的关系,明确ROS在Parthanatos死亡机制中的始动作用。方法:体外培养小鼠海马神经元细胞系HT22细胞,使用GLU诱导HT22细胞来模拟癫痫后细胞损伤体外模型。利用LDH释放试验、Western blot、流式细胞术、酶标法以及ELISA法进行细胞死亡率、ROS、8-OHd G、还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)以及相关蛋白的检测,明确氧化应激在谷氨酸诱导HT22细胞发生Parthanatos死亡中的作用,并证实NAC预处理对细胞的保护作用。结果:(1)GLU诱导的HT22细胞生成的ROS和DNA损伤标志物8-OHd G的水平呈时间依赖性,NAC预处理可有效降低ROS的生成(p0.01)和8-OHd G的表达(p0.01),同时可以提高细胞内GSH的水平(p0.01);(2)NAC预处理可以明显减少GLU诱导的HT22细胞死亡(p0.01),同时降低GLU诱导HT22细胞内PARP-1的表达和PAR的合成,并减少线粒体AIF向核转位。结论:(1)ROS可能是GLU诱导HT22细胞发生Parthanatos死亡的始动因素;(2)NAC可能是通过提高细胞内GSH水平发挥抗氧化损伤的作用;(3)NAC可有效抑制GLU诱导HT22细胞发生Parthanatos死亡。实验三:NAC及PJ34对海人酸诱导的大鼠癫痫模型的神经保护作用及机制研究目的:探讨抗氧化剂NAC及PARP-1抑制剂PJ34在癫痫体内研究中的作用及机制。方法:对Wistar大鼠右侧杏仁核注射KA来制备大鼠癫痫模型,观察大鼠行为学特征及病理学变化(HE染色)。应用NAC及PJ34进行预处理,使用FJB染色、Western blot、酶标法以及ELISA等技术进行相关指标测定,来探索其在体内癫痫模型中的作用机制。结果:(1)杏仁核注射KA诱导大鼠癫痫模型的行为学特征与人类癫痫发作相似,这种模型造模成功率高且死亡率低;(2)在KA点燃大鼠癫痫模型中,海马组织CA1和CA3区可见神经元的损害,其中以CA3区损害为主;(3)PJ34预处理可明显减轻大鼠癫痫发作后海马神经元的损害,具有神经保护作用(p0.01),并抑制海马组织PARP-1的表达和PAR的合成,同时减少线粒体AIF向核转位;(4)NAC预处理明显减轻大鼠癫痫后海马神经元的损害(p0.01)以及DNA的损伤(p0.01),并增加海马组织内GSH的含量(p0.01),同时,NAC预处理可抑制海马组织PARP-1的表达和PAR的合成,并减少线粒体AIF向核转位。结论:(1)在KA点燃大鼠癫痫模型中,海马组织病理改变以CA1和CA3区神经元损害为主(CA3区更为严重);(2)PJ34对大鼠癫痫后海马神经元的损害具有保护作用,其可抑制海马神经元发生Parthanatos死亡;(3)NAC对大鼠癫痫后海马神经元的损害具有保护作用,其可能是通过提高组织GSH的量而减轻癫痫发作造成海马组织的DNA损伤,另外,NAC亦可抑制海马神经元发生Parthanatos死亡。
【图文】：

存活率,细胞的,梯度,作用时间

结果1 GLU 对 HT22 细胞增殖和毒性作用1.1 CCK-8 法检测 GLU 作用时间梯度和浓度梯度对 HT22 细胞的抑制增值作为了研究 GLU 对 HT22 细胞增值率的影响，我们用 CCK-8 法检测 HT22 细胞U 作用浓度梯度和作用时间梯度条件下的细胞增殖活力。如图 2.1 所示，与对，GLU 的作用时间从 6h 延长到 24h，GLU 的作用浓度由 5mM 升高到 20mM，H的存活率明显下降，提示 GLU 抑制 HT22 细胞增殖活性在一定范围内呈剂量赖性。在 GLU 作用 6h 时，HT22 细胞的存活率下降到 87.8%（5mM）、74%（106.5%（20mM）。在 GLU 作用 12h 时，HT22 细胞的存活率下降到 80.2%（5m%（10mM）和 41.3%（20mM）。在 GLU 作用 24h 时，，HT22 细胞的存活率下%（5mM）、22%（10mM）和 13.5%（20mM）。

杀伤作用,细胞的,作用时间,梯度

吉林大学博士学位论文放法检测 GLU 作用时间梯度对 HT22 细胞的细胞LU 对 HT22 细胞杀伤作用的影响，我们用 LDH 释放 GLU 作用时间梯度条件下的细胞杀伤情况。如图细胞的 6h、12h 和 24h 的死亡率分别为 25.2 ±4.8%GLU 对 HT22 细胞的杀伤作用呈时间依赖性。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.1

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