多重作用力稳定的siRNA纳米药物介导神经胶质瘤治疗

发布时间：2020-04-16 09:09

【摘要】：恶性脑神经胶质瘤作为最难以治疗的肿瘤类型之一,由于生长位置的限制使得手术切割不彻底、容易压迫神经、损害正常人体功能等,目前对其仍无有效的临床治疗方案。用于胶质瘤治疗的药物多种多样,核酸类药物如小干扰RNA(siRNA)作为近几年的研究热点,在脑神经胶质瘤治疗中占有一席之地。特别是近年来纳米技术的飞速发展,极大提高了siRNA的递送效率,加速了siRNA药物的临床转化。但诸多递送屏障如血液稳定性、血脑屏障(BBB)、肿瘤主动富集及原位有效释放等仍是目前亟需解决的科学难题。基于此,本课题构建了一种三重作用力(电荷、氢键、疏水)稳定的siRNA纳米药物(3I-NM@siRNA),通过脑靶向配体Angiopep-2(Ang)的修饰,其具有胶质母细胞瘤治疗的潜质。凝胶电泳实验和动态激光光散射结果表明,相对于传统的单重作用力(电荷)稳定的siRNA纳米药物(1I-NM@siRNA),3I-NM@siRNA具有更好的siRNA包裹能力和压缩能力,形成较小的纳米颗粒(38纳米)。生理稳定性实验结果显示,3I-NM@siRNA在负电荷物质肝素钠的竞争下具有更好的稳定性,其血液循环时间(半衰期38分钟)相对于1I-NM@siRNA(半衰期8分钟)也有较大程度的提高。同时,由于本实验采用的疏水稳定分子具有活性氧(ROS)响应性能,使得3I-NM@siRNA在模拟肿瘤微环境的条件下,能够快速有效的释放出装载的siRNA药物,从而发挥其治疗效果。细胞实验结果表明,通过Angiopep-2多肽配体的修饰,3I-NM@siRNA对于人神经胶质瘤细胞U87-MG具有很好的靶向能力。流式定量分析得到Ang-3I-NM@siRNA靶向效率是非靶向纳米粒子的3.5倍。同时,荧光素酶RNA干扰细胞实验进一步证实了其靶向性,Ang-3I-NM@siRNA的基因沉默效率到达80%,远高于同样条件下的非靶向纳米粒子3I-NM@siRNA(50%)。另外,MTT实验结果表明,Ang-3I-NM@siRNA纳米颗粒基本无毒,具有良好的生物相容性。为验证Ang-3I-NM@siRNA的治疗效果,本论文针对Polo样激酶-1(PLK1)为靶点进行了进一步的RNA干扰实验。qRT-PCR和Western Blot结果显示,在siRNA浓度为200 nM的条件下,Ang-3I-NM@siRNA的基因沉默效率在mRNA和蛋白水平分别达到80%和63%,展现出良好的siRNA治疗效果。为进一步验证Ang-3I-NM@siRNA的靶向和治疗效果,本论文构建了原位人神经胶质瘤小鼠模型。siRNA纳米药物的体内生物分布实验结果表明,Ang-3I-NM@siRNA具有更好的神经胶质瘤靶向能力,在肿瘤部位的积累量是3I-NM@siRNA的二倍。选用siPLK1和siVEGFR2(VEGFR2:血管内皮增长因子受体)两种siRNA对神经胶质瘤小鼠进行治疗实验,结果表明,Ang-3I-NM@si(PLK1+VEGFR2)组小鼠的肿瘤增长最缓慢、体重变化最少且小鼠生存周期最长(52天)。肿瘤的组织学HE染色和TUNEL实验结果表明,Ang-3I-NM@si(PLK1+VEGFR2)组具有最好的肿瘤细胞增殖抑制和杀伤效果。采用CD31(血小板-内皮细胞粘附分子)标记血管,通过免疫荧光检测发现,Ang-3I-NM@siVEGFR2和Ang-3I-NM@si(PLK1+VEGFR2)组肿瘤中新生血管的数量相较于其它组明显减少。通过以上治疗结果可知,siPLK1和siVEGFR2具有协同治疗脑神经胶质瘤的效果。综上所述,本论文成功构建了一种三重作用力稳定的脑靶向siRNA纳米药物,其具有较好的血液稳定性、较高的脑肿瘤富集能力以及有效的肿瘤原位siRNA释放。细胞和动物水平实验证实了携带治疗性siRNA的纳米药物具有很好的基因沉默和肿瘤生长抑制效果。此智能型siRNA纳米药物具有人脑神经胶质瘤临床治疗的潜力。
【图文】：

图 1-1 神经胶质瘤中被破坏的关键细胞通路的简图概述（缩写:RTK -受体酪氨酸激酶、PTEN -磷酸酶和紧张素同源物、PI3K -磷酸肌醇激酶、VEGFR -血管内皮生长因子受体、雷帕霉素 mTOR -哺乳动物靶蛋白、MAPK -丝裂原活化蛋白激酶、Cdk -细胞周期蛋白依赖性激酶、Rb -视网膜母细胞瘤蛋白、TCA-三羧酸，IDH -异柠檬酸）[10]。为了靶向治疗脑神经胶质瘤中被破坏的信号通路，研究者们设计合成了各种类型的药物，包括小分子抑制剂（如替莫唑胺 TMZ, 多柔比星 DOX）[26-34]、抗体（如贝伐珠单抗 Bevacizumab）[7, 35-38]、核酸（如 siRNA, miRNA）[39-45]等，其中许多药物已进入临床研究阶段。由于神经胶质瘤在治疗中存在血脑屏障这一障碍，因此对药物要求很高，一般采用对血脑屏障具有渗透性高或能适当打开它的小分子药物进行胶质瘤治疗（如瑞加德松）[46, 47]。1.3 siRNA 用于脑神经胶质瘤治疗

以实现特定的靶向功能。纳米载体与 siRNA 通过静电相互作用、诱捕或接合而产生的纳米制剂的方法被称为 siRNA 纳米医学[65]。目前为止，不同类型的纳米粒子（如图 1-2）已被广泛开发为 siRNA 递送载体，包括有机聚合物（如胶束、纳米凝胶、线性链、树枝状大分子等）、无机纳米粒子（如金、量子点、二氧化硅等）、脂质体，，外泌体、DNA 纳米结构载体以及融合了不同材料的杂化物等[66-71]。各种纳米载体虽然具备高效的 siRNA 装载能力，但在活体输送中，并不能大量高效累积在病灶位点特异性靶向基团的协助能够使纳米粒子准确、快速和高效的到达肿瘤部位。这些靶向基团包括小分子（如生物素、叶酸、半乳糖）[72]、多肽（如 Angiopep-2、cRGD、和 IL-13p[73, 74]和蛋白质（如抗体、转铁蛋白）等[75]。靶向基团的使用不仅使药物被快速的递送到病灶位点，减少对正常组织的副作用，还可通过受体介导的内吞作用大大促进细胞对药物的摄取等[76]。近些年来仿生型生物膜也多被用来包裹纳米粒子，以增强纳米粒子在血液循环中的稳定性和特异靶向能力，其中癌细胞可通过同源归航效应准确到达目标肿瘤部位[47, 77]。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4

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本文编号：2629616