【摘要】：背景脑出血(Intracranial hemorrhage,ICH)是一种具有高患病率和高致死率的疾病。脑出血后往往伴有显著的脑水肿以及高颅压,引起严重的神经功能损伤。然而,由于目前对ICH后神经功能损伤发生的潜在机制仍不清楚,靶向治疗或开发有效药物来治疗ICH仍然是一个挑战。在人类,ICH症状出现后3小时内血肿周围会发生水肿,10-20天后水肿达到高峰。脑水肿会导致颅内压升高,中线结构移位,是发生神经功能损伤的关键因素。ICH后的水肿类型是多样的,但主要形式是由血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)破坏引起的血管源性脑水肿。米诺环素(Minocycline,Mino)是第二代半合成四环素衍生物,具有抗微生物和抑制小胶质细胞激活的作用。在过去的二十年中,Mino作为神经保护剂已被广泛应用于临床实践中。由于其高亲脂性和易穿透组织的特性,Mino可以很容易穿透BBB。尽管有许多研究关注这种化学物质的生理特性和作用,但Mino在ICH后维持BBB的完整性和渗透性并减轻脑水肿的潜在分子机制目前尚不清楚。证据显示Wnt/β-catenin信号通路通过调控多个下游分子的表达来减轻脑水肿和改善ICH的症状。相反,抑制Wnt/β-catenin通路的激活可加重脑水肿和ICH症状。同时,Wnt/β-catenin通路的抑制可增加炎症介质的产生,进而导致ICH预后不良。Dickkopf-1(DKK1)是Wnt/β-catenin通路的上游抑制剂,抑制DKK1的表达可增强Wnt信号通路活性,增加β-catenin的表达。虽然Mino对ICH的脑保护作用,以及它对包括PI3K,MAPK和NF-κB在内的多种信号通路的影响已被广泛报道,但仍有较多未知,例如Mino是否通过作用于DKK1,继而影响Wnt信号通路介导的抗炎反应来发挥神经保护作用尚未见报道。目的在本研究中,我们使用胶原酶诱导的大鼠ICH模型以及体外培养的大鼠小胶质细胞评估Mino对Wnt/β-catenin通路,炎症反应,BBB结构和神经功能的影响,并阐明潜在的分子机制。方法(1)建立胶原酶诱导的大鼠ICH模型,在不同时间点测量脑组织伊文思蓝的外渗和脑含水量来评估BBB的完整性。(2)Mino溶解于盐水中,在建立ICH模型时和12小时后分别以45mg/kg的剂量腹腔内注射,然后每天两次(每次22.5mg/kg)给药,持续2天;siDKK1在ICH模型制作前48小时通过侧脑室注射的方法注入脑室。(3)应用western blot,比较不同组别中(Sham;ICH+vehicle;ICH+siNC;ICH+siDKK1;ICH+Mino;ICH+siDKK1+Mino)DKK1,Wnt1,β-catenin,Occludin蛋白的表达变化。(4)将数量为4.0×10~5的大鼠小胶质细胞置于12孔板中,用大肠杆菌LPS(不同浓度)处理24小时,然后通过ELISA测定无细胞上清液的细胞因子和MMP-9水平。用大肠杆菌LPS处理4小时后收集全细胞裂解物,通过western blot测定Wnt通路蛋白及Occludin蛋白表达水平。(5)为了进一步研究DKK1的功能,我们采用CD11b/c,NeuN和GFAP等分子标记,通过免疫荧光法检测DKK1在血肿周围组织中的细胞定位。(6)采用神经功能缺损评分和神经功能测试(包括前肢放置、前肢使用不对称试验和转角试验)来评价神经功能状况。结果(1)与sham组相比,ICH组出血侧基底节区伊文思蓝的渗出量明显增加。与第1天和第7天比较,伊文思蓝外渗在ICH后第3天最显著(P0.001)。此外,脑含水量在ICH后第1天和第3天基底节区也显著增加,但在第7天没有明显增加。和第1天和第7天比较,第3天脑含水量最高(P0.01)。(2)与vehicle组相比,Mino组出血侧基底节区伊文思蓝外渗在第3天明显减少(P0.05)。同时,Mino治疗组出血侧基底节区脑含水量与vehicle组比较,也有显著减少(P0.01)。(3)与vehicle组相比,Mino治疗组血肿周围组织中DKK1的表达显著降低(P0.01)。此外,免疫组化显示ICH后血肿周围组织中DKK1的表达显著增加,而Mino治疗后可抑制ICH引起的DKK1增加,western blot的结果也和其一致。通过采用包括CD11b/c,NeuN和GFAP在内的多种分子标记的免疫荧光来检测DKK1在血肿周围组织中的定位,结果发现DKK1与CD11b/c、NeuN阳性细胞共定位,但不与GFAP阳性细胞共定位。随后我们研究了Mino对大鼠小胶质细胞中DKK1表达和炎症介质产生的影响。与vehicle组相比,Mino强烈地降低DKK1的表达,同时显著增加β-catenin的表达。为进一步研究Mino的抗炎作用,使用大肠杆菌LPS(TLR4的经典激动剂)分别在有和无Mino的情况下处理小神经胶质细胞,结果显示Mino预处理显著降低了LPS诱导的TNF,IL-6和MMP-9的产生。(4)与vehicle组相比,Mino治疗组显著增加了血肿周围脑组织中Wnt1,β-catenin,Occludin蛋白的表达(Wnt1:P0.01;β-catenin:P0.01;Occludin:P0.05),表明Mino可激活Wnt1及其下游分子(β-catenin,Occludin蛋白)。与ICH组相比,使用siDKK1抑制DKK1可使Wnt1,β-catenin和Occludin的表达明显增加(Wnt1:P0.01;β-catenin:P0.01;Occludin:P0.05)。此外,siDKK1抑制DKK1同时使用Mino处理可发挥协同作用,与任一单因素处理组相比差异均有统计学意义(Wnt1:P0.05;β-catenin:P0.05;Occludin:P0.01)。我们还评估了Mino和siRNA介导的DKK1缺乏对BBB完整性和通透性的影响,发现与vehicle组相比,Mino治疗后伊文思蓝渗出量和脑含水量明显降低(P0.05),且Mino+siDKK1组较单一处理组相比这种减弱作用更显著(P0.05)。ICH后第3天的神经功能缺损检查显示,Mino或siDKK1治疗均可明显减轻神经功能缺损,包括神经功能评分、转角试验、前肢放置和前肢使用不协调评分(P0.05),表明Mino和siDKK1具有神经保护作用,而Mino+siDKK1治疗组与单Mino组或单siDKK1组比较差异无显著性(P0.05)。结论Mino通过抑制血肿周围组织(小胶质细胞为主)中DKK1表达,导致Wnt/β-catenin信号通路激活,炎症反应抑制,从而减轻BBB破坏,最终改善ICH后的神经功能损伤。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.34
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本文编号：
2632947
