长链非编码RNA-LINC00662调节胶质瘤血管生成拟态的机制研究

发布时间：2020-04-19 01:28

【摘要】：目的:恶性脑胶质瘤是以血管异常增生为特征的中枢神经系统恶性肿瘤。研究人员试图通过抗血管生成治疗来遏制胶质瘤的进展,但是血管生成拟态对于胶质瘤抗血管生成治疗并不敏感。因此,抑制血管生成拟态形成作为肿瘤内皮依赖性血管生成治疗的有效补充方法,将可能成为未来胶质瘤综合治疗的发展方向。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,LncRNAs)是一类不具编码能力且长度超过200个核苷酸的RNA。有研究表明lncRNAs在胶质瘤发生发展过程中发挥重要的调控作用。LINC00662广泛表达于脑、卵巢等全身各种组织内,但具体生理功能不明。同时,尚无研究报道LINC00662在胶质瘤中的表达水平以及是否参与调控胶质瘤血管生成拟态。MicroRNAs(miRNAs)是一类在调节基因表达中起重要作用的短链非编码RNA,它能够结合靶基因mRNA 3'-非翻译区(3'-UTR)并负向调控靶基因的表达。已有研究表明miR-874-3p在多种恶性肿瘤中表达水平下调并且发挥抑癌因子作用。但是,目前有关miR-874-3p在胶质瘤中的表达以及是否参与调控胶质瘤血管生成拟态尚未见报道。本研究旨在研究LINC00662在胶质瘤组织和细胞中的表达水平并探讨LINC00662参与调控胶质瘤血管生成拟态形成及相关恶性生物学行为的具体作用机制,进一步为胶质瘤的综合治疗寻找到新的治疗靶点。研究方法:1、应用CD34-PAS染色检测胶质瘤病理切片中的血管生成拟态;2、应用Real-time PCR检测人胶质瘤组织和U87、U251细胞系中LINC00662、miR-874-3p的表达水平;3、转染沉默质粒降低U87、U251胶质瘤细胞系中LINC00662的表达水平以制备LINC00662表达沉默的细胞系;4、构建SDC1表达沉默的胶质瘤细胞系;5、构建miR-874-3p过表达和表达沉默的胶质瘤细胞系;6、应用CCK-8细胞增殖实验检测上述基因表达变化对U87、U251细胞活力的影响;7、应用Transwell迁移、侵袭实验检测上述基因表达变化对U87、U251细胞迁移和侵袭的影响;8、应用Matrigel管腔形成实验检测胶质瘤细胞血管生成拟态形成能力;9、应用Western blot检测胶质瘤细胞中的SDC1、ROCK1、ROCK2、RhoA以及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的内源性表达水平;10、采用双荧光素酶报告基因分析检测LINC00662与miR-874-3p以及miR-874-3p与SDC1之间是否存在靶向作用关系;11、应用RNA结合蛋白免疫共沉淀实验研究LINC00662、miR-874-3p与Ago2之间的靶向作用关系。结果:1、LINC00662在胶质瘤组织及细胞系中高表达,且与胶质瘤血管生成拟态正相关;2、在胶质瘤细胞系中,沉默LINC00662的表达能够显著抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成拟态形成能力并下调MMP-2及MMP-9的表达水平;3、胶质瘤组织及细胞系中miR-874-3p的内源性表达水平显著高于正常脑组织及细胞系;4、过表达miR-874-3p能够显著抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成拟态形成能力并下调MMP-2及MMP-9的表达;5、在胶质瘤细胞中,沉默LINC00662表达后能够显著上调胶质瘤细胞中miR-874-3p的表达;6、LINC00662与miR-874-3p之间存在靶向结合作用。同时,二者能够共同富集于Ago2复合体中;7、沉默LINC00662通过上调miR-874-3p的表达水平,能够显著抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成拟态形成能力并下调MMP-2及MMP-9的表达;7、miR-874-3p能够靶向结合SDC1。同时,LINC00662作为miR-874-3p的ceRNA,能够正性调控SDC1的表达;8、沉默SDC1通过抑制RhoA/ROCK信号通路,显著下调MMP-2及MMP-9的表达。结论:1.LINC00662在胶质瘤组织和细胞中表达增高,且与胶质瘤血管生成拟态正性相关。沉默LINC00662通过上调miR-874-3p的表达,抑制胶质瘤血管生成拟态的形成。2.过表达miR-874-3p能够靶向结合并下调SDC1的表达,抑制胶质瘤血管生成拟态的形成。3.沉默SDC1通过抑制RhoA/ROCK通路,以及下调血管生成拟态相关因子MMP-2和MMP-9的表达,进而抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4

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本文编号：2632771