枸杞多糖对脑缺血再灌注损伤的作用及机制研究

发布时间：2020-04-19 23:44

【摘要】：研究背景:脑卒中是最常见的死亡方式之一,并且具有较高的致死率、致残率和较多并发症,严重的威胁着全球人类的健康。脑卒中给健康和经济带来巨大的影响,极大的消耗医疗资源。其中缺血性脑卒中占整体脑卒中60%以上,缺血性脑卒中是由血栓、栓塞或系统性低灌注造成的,这些因素可以导致局部脑血流量受限,最终造成支持细胞稳态的氧、糖供应不足。同时,再灌注可造成二次脑组织损伤及其他并发症,在脑缺血损伤中也发挥重要作用。脑缺血再灌注损伤可诱发多因素、多机制和有害的级联反应,包括能量代谢障碍、氧化应激、兴奋毒性、钙超载、血脑屏障损伤、炎症、细胞凋亡基因激活等。除上述之外,最近的研究表明自噬也是参与脑缺血再灌注损伤的重要机制。自噬不仅是一种防御机制可清除细胞质中的受损细胞器和代谢产物,也会激活细胞死亡程序诱导细胞死亡。这些机制间相互加强,相互联系,相互重叠,形成恶性循环,最终可导致神经元死亡。目前缺血性脑卒中的治疗措施包括急性溶栓、血管再通及搭桥等方法,但急性期后的治疗效果仍然有限。因此,必须寻找新的治疗靶点,提高患者预后。在我国传统中医药方面,中药由于其作用缓和、副作用少并且具有多重保护作用而被广泛应用于临床治疗,并取得了较好的临床效果。枸杞是一种非常重要的传统中药材,具有多种生物活性和药理作用。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)是枸杞的主要活性成分。之前的一些研究证实LBP具有调节免疫,抗肿瘤,抗衰老和抗氧化等作用。此外,近几年已有研究表明LBP可减轻神经元损伤,发挥神经保护作用,但LBP发挥神经保护作用的具体机制目前尚不清楚。PI3K/Akt/m TOR(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin)信号通路是控制细胞增殖、生长、代谢和存活的关键,依赖于多种机制。这条信号通路对脑缺血的神经保护作用目前已被广泛研究。之前的研究表明,激活PI3K/Akt/m TOR信号通路可下调自噬;并且这条通路能够抑制凋亡和自噬,促进细胞周期。因此,PI3K/Akt/m TOR信号通路与凋亡和自噬具有高度的相关性。基于以上的研究背景,本研究旨在探讨LBP对神经元的保护作用,及LBP通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路对凋亡和自噬的影响。研究目的:本研究建立了原代海马神经元OGD/R(oxygen glucose deprivation and reoxygenation)损伤模型拟观察和探究:(1)LBP对神经元的保护作用;(2)LBP对神经元凋亡的作用;(3)LBP对神经元自噬的作用;(4)LBP通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路对凋亡和自噬的影响。研究方法:1、成熟后的原代海马神经元氧糖剥夺条件下培养3小时,正常条件下复氧24小时,建立离体脑缺血再灌注损伤模型;2、处理后的神经元被随机分为5组,正常对照组(Control)、氧糖剥夺再灌注损伤组(OGD/R)、LBP低、中、高剂量(15,30,60μg/ml)处理组。LBP于氧糖剥夺后,再灌注之前加入;3、海马神经元存活率的评估通过检测MTT;海马神经元损伤的评估通过检测LDH的释放量;4、采用DCFH-DA荧光探针检测神经元中ROS水平;通过TBA比色法测定MDA水平;5、采用TUNEL荧光染色法评价神经元细胞凋亡水平;6、采用免疫荧光染色法测定cleaved-Caspase3、LC3及Beclin 1的表达水平;7、采用透射电镜观察自噬小体和自噬溶酶体的形态及数量;8、采用免疫印记法检测cleaved-Caspase3,Caspase3,Bax,Bcl-2,LC3-II,LC3-I,Beclin 1,p62,p-m TOR,m TOR,p-Akt,Akt蛋白表达。研究结果:第一部分:与Control组相比,OGD/R组显著降低神经元存活率,并且增加了LDH的释放率;与OGD/R组相比,LBP(15,30,60μg/ml)处理组显著降低LDH的释放率,且增加神经元的存活率。与此同时,OGD/R组诱导ROS和MDA水平升高,与Control组相比;LBP(15,30,60μg/ml)处理组可降低OGD/R损伤诱的ROS和MDA水平。第二部分:与Control组相比,TUNEL阳性凋亡细胞数量在OGD/R组中增加;LBP(15,30,60μg/ml)处理组中可观察到TUNEL阳性凋亡细胞数较OGD/R组减少。此外,本研究还检测了凋亡相关蛋白的表达,与Control组相比,OGD/R组中cleaved-Caspase3/Caspase3比值增加,Bcl-2/Bax比值降低;与OGD/R组相比,LBP(15,30,60μg/ml)处理组中cleaved-Caspase3/Caspase3比值降低,Bcl-2/Bax比值增加。并且免疫荧光检测cleaved-Caspase3表达与Western Blot法结果相似。第三部分:在OGD/R损伤后,Beclin 1蛋白表达水平和LC3II/LC3I比值增加,p62蛋白表达水平降低,与Control组相比;LBP(15,30,60μg/ml)处理组可降低Beclin 1蛋白表达水平和LC3-II/LC3-I比值,增加p62蛋白表达水平。同时,免疫荧光检测LC3和Beclin 1表达与Western Blot法结果相似。电镜观察OGD/R组中自噬小体和自噬溶酶体数量较正常对照组显著增多;LBP 60μg/ml处理组中自噬小体和自噬溶酶体数量较OGD/R组减少。第四部分:在OGD/R损伤后,p-Akt和p-m TOR蛋白表达水平降低,与Control组相比;然而,LBP(15,30,60μg/ml)处理组上调p-Akt和p-m TOR表达水平。为了进一步探究LBP与PI3K/Akt/m TOR信号通路的关系,本研究采用了PI3K特异性抑制剂LY294002,结果显示LBP 60μg/ml处理组可上调p-Akt和p-m TOR表达水平,下调cleaved-Caspase3、LC3-II表达水平,减轻神经元损伤,发挥神经保护作用。研究结论:1、LBP可减轻海马神经元OGD/R损伤,具有神经保护作用;2、LBP可减轻OGD/R损伤诱导的海马神经元细胞凋亡;3、LBP可抑制OGD/R损伤诱导的海马神经元自噬性细胞死亡;4、LBP可激活PI3K/Akt/m TOR信号通路抑制OGD/R损伤诱导的神经元凋亡和自噬性细胞死亡,发挥神经保护作用。
【图文】：

缺血再灌注损伤,学说,脑缺血再灌注损伤

由于脑组织对氧含量和能量供应的变化十分敏感，以及神经元细胞为不可再生的细胞特性，因此，一旦缺血、缺氧损伤造成神经元死亡，，由此所造成的神经功能损伤将难以恢复。脑缺血再灌注损伤是指缺血区域在恢复血液灌注后出现脑组织损伤加重和神经功能障碍的现象。在脑缺血再灌注损伤中，血流量低灌注核心区域的神经元细胞死亡是无力扭转的，但在其周围半暗带存在的大量濒死状态神经元内部血流灌注量也明显低于正常值，及时、有效的给予适当的治疗方法能够降低细胞发生凋亡和坏死，提高细胞存活率。Abtrup 在 1977 年首次将此部分描述为缺血半暗带（Ischem ic penum-bra，IP），使人们有了新的认识，开辟了脑缺血再灌注损伤治疗的新大陆，改善缺血半暗带内神经元细胞的存活及功能状态成为了治疗脑缺血再灌注损伤的重要靶点[19, 20]。近年来，随着基础研究与医学技术的长足发展，关于脑缺血再灌注损伤的病理机制也被进一步研究，例如能量代谢障碍、自由基与氧化应激损伤、钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应、血脑屏障损坏、细胞凋亡等，这些机制发生于不同时间点，互为因果、相互重叠、相互联系（图 1）。

脑缺血损伤,形成机制,应激,细胞内

图 2：脑缺血损伤后细胞内氧化/氮化应激形成机制（引自 Chamorro á，et al. Lancet Neurol. 2016 Jul;15（8）:869活性氧自由基与氧化应激损伤自由基在脑缺血再灌注损伤中通过多种途径生成，引发氧化基的生成导致脂质、蛋白质及核酸发生过氧化，正常膜结构进一步造成线粒体变性、裂解，神经元发生不可逆改变，最由基导致兴奋性氨基酸释放增加，重摄取受阻，造成神经毒损伤，尤其在再灌注时期，自由基的产生与内源性抗氧化系形成恶性循环；④内皮细胞损伤导致血-脑屏障受损，通透性微循环受阻；⑤花生四烯酸代谢失常，向血栓烷 A2 转化增多挛、血小板聚集，导致梗死面积增加，加重损伤；⑥细胞因，介导免疫和炎症反应，导致损伤加重；⑦促使大分子物质如 D糖等交联增加，导致原本的生物学活性降低[24]。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743

【参考文献】