汉族人群中多巴反应性肌张力障碍的分子遗传学研究

发布时间：2020-04-20 14:37

【摘要】：目的对汉族人群中的多巴反应性肌张力障碍(DRD)患者的GTP环化水解酶1基因(GCH1)、酪氨酸羟化酶基因(TH)进行测序,探究DRD发病与基因突变的关系,扩充与该病相关的基因突变范围。并且采用MLPA技术分析GCH1、TH、Epsilon-sarcoglycan编码基因(SGCE)上是否存在外显子缺失,进一步探究DRD的遗传学发病机制,以便更好的发挥辅助诊断的作用。方法收集4个DRD家系共8名患者及其5名无症状家属、10名散发性DRD患者和40名正常对照者的外周血样本,并记录临床资料。采用高盐法提取其外周血全基因组DNA,对GCH1、TH基因上的所有外显子和剪接点进行PCR扩增,用Mutation Surveyor software(SOFTGENETICS)软件对扩增产物进行序列分析,检测突变位点。当发现存在基因突变,则与正常基因的该位点碱基序列进行对比分析。然后进一步对DNA样品进行磁珠纯化,应用多重连接依赖式探针扩增(Multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术与实时定量PCR(Real time PCR)技术相结合,对GCH1、TH、SGC五基因共22个外显子(GCH1基因6个外显子,TH基因5个外显子,SGCE基因11个外显子)进行分析。实验严格依照MRC-Holland公司提供的技术方案SALSA P099-C1 GCH1-TH-SGCE进行基因外显子的定量。MLPA剂量值用Coffalyser程序计算。采用qPCR实验进一步验证MLPA结果,用SYBR Green荧光定量法在ABI 7500 Fast PCR仪上进行扩增,qPCR反应结果采用ddCt法(ddCt值=mean±SD),通过与正常对照基因的Ct值进行比较来计算基因表达的差异,分析GCH1外显子缺失情况。结果1 9号家系中4名患者均检出GCH1基因1号外显子发生杂合点突变Ala98VaI(454CT),使编码的丙氨酸(Alamine)变成缬氨酸(Valine)。1名男性同样携带此突变,但没有表现DRD症状。2 10号家系中1名34岁女性患者的GCH1基因2号外显子发生突变Ile135Thr(37449TC),导致编码的异亮氨酸(Isoleucine)变成苏氨酸(Threnine)。该患者的父亲和哥哥同样携带此突变,虽然没有明显的DRD症状,但是患有抑郁症。3 12号家系中,2名女性患者GCH1基因1号外显子存在杂合突变Tyr75Cys(385AG)。她们的正常同胞姐妹没有携带该突变。4 2名散发性DRD患者TH基因1号外显子和12号外显子发生两种杂合突变Ser19Cys(75CG)、Gly397Arg(6127GA)。5 MLPA反应结果:1名散发性DRD患者的GCH1基因1号外显子上与142nt和254nt探针结合的目标序列的相对峰值率(RPR)约为0.5,而正常的比值应为0.75-1.25。表明出现杂合缺失。其余被检测者的GCH1、TH、SGCE基因外显子均未见缺失。6采用qPCR对MLPA结果进行验证,结果用ddCt法将患者与正常对照者基因Ct值进行比较,用二者之间的相差来计算基因表达的差异,通过计算得出22号患者的GCH1基因1号外显子ddCt值(mean±SD)为0.9,正常对照者ddCt值为0。表示22号患者GCH1基因1号外显子出现缺失。结论1在汉族人群中,GCH1基因在家族性DRD患者中突变频率相对较高。3个新的GCH1基因错义突变在3个家系中被检出,但有部分患者(多数为散发性患者)未检出GCH1、TH突变;携带相同突变的家族性DRD患者的症状和发病年龄均表现出一定的差异性,因此,DRD具有不完全外显性。基因筛查可以作为临床诊断的辅助手段。2散发性DRD患者GCH1基因存在外显子缺失,但出现频率较低;对于未检出基因突变的散发性DRD患者,有必要检测GCH1基因是否存在缺失。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R746

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本文编号：2634652