小檗碱诱导胶质瘤死亡方式及其干扰脂肪酸代谢的研究

发布时间：2020-04-22 09:46

【摘要】：背景:胶质瘤发病率大约占中枢神经系统恶性肿瘤的70%,严重影响了患者的生存期,尽管患胶质瘤病人接受了手术、放疗、化疗等综合治疗,由于肿瘤的异质性及其高代谢对凋亡的抗性导致患者预后较差,因此探索通过调控胶质瘤代谢诱导胶质瘤发生非凋亡方式死亡具有重要的临床意义。同时研究显示,肿瘤的一个重要特点就是脂类物质过多合成及利用,脂类物质对肿瘤进行生物合成及细胞增殖具有重要作用;胶质瘤脂肪酸合成酶明显增加,与胶质瘤WHO分级呈正相关,抑制胶质瘤脂肪酸合成能有效抑制胶质瘤增殖。探索抑制胶质瘤脂肪酸合成药物成为治疗胶质瘤的有效手段。胀亡是一种非经典的死亡方式,主要表现为细胞浆内大量空泡,细胞膜出泡及细胞核溶解,与细胞内ATP快速下降及线粒体损伤具有密切相关性,其形态学特征不同于细胞凋亡,胀亡作为一种杀死癌细胞的新策略正在被积极探索。文献报道天然化合物如青蒿素、澳洲茄边碱及合成抗生素铜硫甲酰素能够有效通过胀亡这种死亡方式诱导肿瘤死亡。小檗碱是从中药黄连中分离的一种季铵生物碱,在中国被用于治疗肠道感染数百年,同时发现小檗碱具有抗肿瘤作用。另外发现小檗碱具有调控血糖、血脂作用,而糖、脂类等物质在线粒体中进行氧化高效提供ATP对胶质瘤的生存发挥巨大作用。目前为止,小檗碱是否能诱发胶质瘤发生胀亡及降低胶质瘤脂肪酸合成尚不明确,因此我们分别应用胶质瘤细胞及胶质瘤细胞体内成瘤内模型探索小檗碱对胶质瘤的抑制作用。目的:本研究的目的是探索小檗碱诱导胶质瘤死亡方式及其对胶质瘤脂肪酸合成的影响,进一步探索其作用分子机制。方法:MTT检测药物对细胞存活率的影响、相差显微镜及透射电镜观察细胞形态结构变化、流式细胞术观察细胞死亡形式、自噬双标腺病毒(Ad-m CherryGFP-LC3B)感染标记细胞检测细胞自噬、线粒体染色观察线粒体形态学变化、seahorse检测细胞线粒体耗氧量及糖酵解及细胞代谢状态等代谢改变,western blot及免疫组化检测相关蛋白变化细胞克隆实验观察小檗碱对胶质瘤增殖的影响,细胞划痕实验及transwell小室实验观察胶质瘤迁移及侵袭,质谱法及磷脂染色法检测细胞脂类变化,western blot及免疫组化检测PI3K/AKT/SREBP1/FASN信号通路蛋白变化。结果:1.MTT显示小檗碱显著降低细胞存活率,呈时间依赖性及浓度依赖性,胶质瘤细胞呈胀亡样死亡,细胞内出现大量空泡,细胞膜出泡,流氏细胞学检测细胞死亡细胞PI+,seahorse检测细胞OCR减少,转向糖酵解产ATP,ATP产量急剧下降,细胞及线粒体ERK蛋白活性下降。2.小檗碱导致胶质瘤细胞内ROS升高,GSH及NADPH显著下降(P0.05),具有显著统计学意义,应用NAC清除ROS不能有效提高胶质瘤生存率(P0.05),也不能提高胶质瘤ATP生成。3.小檗碱抑制胶质瘤细胞克隆形成具有浓度依赖性,显著抑制胶质瘤侵袭及迁移能力(P0.05),同时细胞内脂肪酸,磷脂显著下降,磷酸化PI3K和磷酸化AKT蛋白显著下调,SREBP1活性成分及FASN表达下调。结论:1.小檗碱通过抑制线粒体ERK蛋白抑制线粒体有氧呼吸供能,使细胞内ATP产能下降,出现ATP快速耗竭,导致胶质瘤细胞以胀亡方式死亡。2.小檗碱导致胶质瘤抗氧化能力下降。3.小檗碱通过下调PI3K/AKT/SREBP1/FASN下调胶质瘤脂肪酸合成,从而抑制胶质瘤增殖,迁移及侵袭能力。
【图文】：

标志[5]。实验证明，在胶质瘤中其显著特征也是代谢重组，其不仅通过糖酵解进行底物供应，，同时进行葡萄糖氧化、脂肪酸氧化等多种手段维持胶质瘤生长[2, 6-9]。线粒体是肿瘤物质代谢的至关重要器官之一，其在能量供应，肿瘤底物如脂肪酸、氨基酸、核酸代谢中发挥重要作用[10-12]，如图 1.1。

系列生物化学反应，最终经过脂肪酸合成关键酶-脂肪酸合成酶（fatty acidnthase, FASN ）作用形成棕榈酸酯，进一步经过硬脂酰辅酶 A 脱氢酶stearoyl-CoAdesaturase，SCD）形成单不饱和脂肪酸，形成不同形式脂肪酸进存储，脂肪酸也可经过胆固醇转化获得[30]（图 1.2）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

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