SNW1通过与RBPJ相互作用调节神经母细胞瘤Notch信号通路的机制研究

发布时间：2020-04-23 18:00

【摘要】：第一部分转录因子RBPJ参与神经母细胞瘤Notch信号通路调控过程目的:探索研究神经母细胞瘤(NB)中参与Notch信号通路过程中的关键转录调控因子,并探索该转录因子在神经母细胞瘤中的调控作用。方法:通过综合分析GEO(GSE62564)数据库,找到参与神经母细胞瘤分期、进展及MYCN扩增的Notch信号通路相关转录因子,综合分析出有意义的转录因子,进一步通过GEO数据库分析该转录因子在神经母细胞瘤中生存意义并分析该转录因子在神经母细胞瘤不同分期、进展及MYCN扩增的NB中的表达水平。进一步通过蛋白免疫印迹(Western-blot),免疫组织化学方法(IHC)检测该转录因子在分化良好的神经母细胞瘤、低分化神经母细胞瘤及未分化神经母细胞瘤组织中表达水平,并探讨其是否具有临床意义,最后通过实时定量PCR、Ch IP等实验方法证实该转录因子对Notch信号通路调节过程中相关基因的转录活性及表达水平的影响。结果:GEO数据库综合分析显示转录因子MAML3与RBPJ是可能参与神经母细胞瘤Notch信号通路过程的关键转录因子。GEO数据库(GSE62564)分析上述两种转录因子在神经母细胞瘤中的生存,我们选择了生存意义较大的RBPJ进行分析,GEO(GSE62564)数据库分析、免疫组化、及Westren-blot检测神经母细胞瘤细胞株和不同分化组织中的结果表示,RBPJ在神经母细胞瘤中呈现出高表达状态。在神经母细胞瘤细胞株中敲低RBPJ可以显著增加Notch信号通路相关基因HES1,HES4,HEY1,HEY2的转录水平(p0.01),但对OCT4的转录水平无明显影响(p0.05)。此外,敲低RBPJ能够明显抑制RBPJ与下游启动子区域的结合(p0.01)。结论:在神经母细胞瘤细胞中,转录因子RBPJ可以通过结合相关Notch信号通路相关基因的转录调控,具体调节基因为HES1,HES4,HEY1和HEY2,同时,RBPJ在神经母细胞瘤中作为一个预后不良因素存在。第二部分SNW1蛋白与转录因子RBPJ在神经母细胞瘤中相互作用目的:探讨在神经母细胞瘤中与转录因子RBPJ相互作用的蛋白,进一步探索RBPJ上游的调控。检测该上游蛋白在神经母细胞瘤中的表达情况,并验证其相互作用。方法:利用IID,Bio GRID和STRING数据库,分析与RBPJ相互作用的蛋白,通过IP和考马斯亮蓝染液方法进一步验证上述数据库所推导蛋白;通过正向和反向Co-IP进一步验证转录因子RBPJ与其相互作用,利用双分子荧光互补实验(Bi FC)验证二者是否直接相互作用。通过GEO(GSE62564)数据库分析互作蛋白生存意义及探究其与神经母细胞瘤分期、进展、MYCN扩增的转录水平,通过免疫组织化学方法(IHC)检测该蛋白在节细胞神经母细胞瘤、分化良好的神经母细胞瘤、低分化神经母细胞瘤及未分化神经母细胞瘤组织中表达水平,探讨其是否具有临床意义;结果:综合多种蛋白互作数据库分析发现转录因子RBPJ可能与7种蛋白相互作用,接下来在神经母细胞瘤细胞株中通过IP和考马斯亮蓝染色进一步验证了RBPJ可能与SNW1相互作用;此外,通过正向和反向Co-IP验证了RBPJ与SNW1相互作用,双分子荧光互补实验(Bi FC)证实了其推导的正确性;通过GEO(GSE62564)数据库分析表明SNW1的生存意义(p0.01),并与神经母细胞瘤的分期、进展及MYCN的扩增密切相关(p0.01),临床标本SNW1表达水平在节细胞神经母细胞瘤、分化良好的神经母细胞瘤、低分化神经母细胞瘤及未分化神经母细胞瘤组织中依次升高(p0.01),数据库分析结果表明,SNW1与RBPJ其转录水平呈正相关性,其中R=0.3975(p0.01)。结论:这些数据表明SNW1能够与RBPJ相互作用,SNW1在神经母细胞瘤中作为预后不良因素且与RBPJ呈正向相关性。第三部分SNW1抑制Notch信号通路通过与RBPJ相互作用目的:探讨在神经母细胞瘤中SNW1调控Notch信号通路的机制。方法:建立并筛选稳定敲低RBPJ与过表达/敲低SNW1的神经母细胞瘤细胞株,评估过表达/敲低SNW1对神经母细胞瘤细胞株Notch信号通路的调控过程,RBPJ与SNW1进行回补实验,通过Western-blot进行RBPJ与SNW1表达水平的验证,并进一步通过实时定量PCR对Notch信号通路下游靶基因HES1、HES4、HEY1、HEY2和OCT4转录水平的检测,通过回补实验研究SNW1调控Notch信号通路的调控机制。结果:与对照组相比,过表达SNW1能够明显抑制Notch信号通路靶基因HES1,HES4,HEY1,HEY2的转录水平(p0.01),但是对OCT4的转录水平无明显影响(p0.05)。相应地,敲低SNW1能够明显促进HES1,HES4,HEY1,HEY2的转录水平(p0.01),对OCT4的转录水平无明显影响(p0.05)。回补实验结果表明(p0.01),在敲低RBPJ的情况下,SNW1不能够对Notch信号通路进行调节。结论:SNW1能够抑制Notch信号通路,是通过与RBPJ相互作用进行调控的。
【图文】：

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文利用 Prism 8 (GraphPad)软件进行相关统计学分析2 实验结果1. 神经母细胞瘤中与Notch信号相关的关键转录因子1.1 通过GEO数据库，分析在神经母细胞瘤中与Notch信号通路相关的关键转录因子。通过 GEO 数据库(GSE62564)分析 498 例数神经母细胞瘤的病人，分析与神经母细胞瘤进展、分期、MYCN 扩增相关的 Notch 信号相关转录因子，取其交集，我们得到了转录因子 MAML3 与 RBPJ，接下来进一步分析这两种转录因子生存意义的大小。图（1.1A 与 B）

图 1.2 该图显示 RBPJ 在神经母细胞瘤进展期、临床高分期及 MYCN 扩增患者表达水平增高。1.3 神经母细组织标本及细胞系中检测 RBPJ 表达水平。收集临床上神经母细胞瘤节细胞神经母细胞瘤、分化良好神经母细胞瘤、低分化神经母细胞瘤、未分化神经母细胞瘤的组织标，，WB 及 IHC 实验表面（图 2.1A 与B），在未分化组织标本中，RBPJ 蛋白水平明显增高。在神经母细胞系中 IMR-32中表达较高，SH-SY5Y 表达较低，而 SK-N-AS、SK-N-SH 中表达中等(图 2.1 C)，因此我们选择 SK-N-AS 和 SK-N-SH 来进行下一步的实验研究。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 王静;秦悦;刘群;唐雨佳;武煜明;蔡恩丽;褚鑫;;Notch信号通路在针刺治疗中枢神经系统疾病中作用机制研究[J];针灸临床杂志;2019年06期

2 王琨;梁伟;朱波;朱丽华;熊御云;龚爱华;;Notch信号通路相关微小RNA在胶原蛋白诱导的关节炎小鼠免疫细胞中的表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2018年10期

3 李余星;秦冰杰;刘小虎;谭潇;郑军;郑卫红;;Notch信号通路在长春新碱诱导神经病理性疼痛中的作用[J];中国疼痛医学杂志;2019年08期

4 王燕芹;马蕾;;Notch信号通路在银屑病发病机制中的研究进展[J];中国免疫学杂志;2018年10期

5 刘建中;胡广军;时玲玲;陈辉;孙清森;;Notch信号通路参与肝癌细胞侵袭迁移临床机制研究[J];临床军医杂志;2017年11期

6 宋波;陈日玲;廖凤玲;;Notch信号通路对VEGF促小鼠胚胎干细胞分化成为造血干/祖细胞的作用[J];中国实验血液学杂志;2018年06期

7 倪少俊;雷悦;徐秋月;王成;刘珑玲;;Notch信号通路在烧伤感染患者淋巴细胞中的表达研究[J];中国当代医药;2018年30期

8 黄旺业;赵志梅;;Notch信号通路与急性肺损伤关系的研究进展[J];吉林医学;2019年01期

9 王军;李良志;谭琴兰;周海英;;Notch信号通路在IgA肾病肾间质纤维化中的表达和意义[J];中国中西医结合肾病杂志;2019年02期

10 李_g;张鸿;李竹;刘清娥;王璐;张丹;曹宁家;苏莉;;Notch信号通路对慢性丙型肝炎患者CD8~+T淋巴细胞功能的影响[J];临床肝胆病杂志;2018年02期

相关会议论文 前10条

1 钟远鸣;;Notch信号通路与退变的髓核细胞的研究进展[A];第七届全国中西医结合骨科微创学术年会论文汇编[C];2017年

2 罗雪婷;祝颂松;;Notch信号通路在颞下颌关节骨关节炎发生中的作用[A];第十四次中国口腔颌面外科学术会议论文汇编[C];2018年

3 袁萍;高晓蔚;李淑慧;吴佩玲;;Notch信号通路相关分子在牙周膜干细胞中表达的试验研究[A];中华口腔医学会全科口腔医学专业委员会第六次学术会议暨广东省口腔医学会全科口腔医学专委会2015年年会论文集[C];2015年

4 罗雪婷;祝颂松;;Notch信号通路在颞下颌关节骨关节炎发生中的作用[A];中华口腔医学会第十五次全国颞下颌关节病学及牙合学学术研讨会论文汇编[C];2018年

5 郑大利;魏华;卢友光;;EGCG通过抑制Notch信号通路抑制KRas突变小鼠口腔异型性增生[A];2019年中华口腔医学会口腔预防医学专业委员会第十九次全国学术年会资料汇编[C];2019年

6 李嘉怡;高荣;孙惠强;赵娅雯;文静;;流体剪切力通过Notch信号通路促进MC3T3-E1细胞中NO的释放和成骨细胞分化[A];中华口腔医学会口腔修复学专业委员会第十次全国口腔修复学术大会论文集[C];2016年

7 赵丹;刘梦婷;李谦顺;张晓琳;薛昌越;林云锋;蔡潇潇;;DNA四面体纳米材料通过Notch信号通路促进内皮细胞增殖、迁移和血管生成[A];2019第九次全国口腔生物医学学术年会论文汇编[C];2019年

8 刘丹;;雷公藤红素在IgA肾病大鼠Notch信号通路表达中的作用[A];2016年中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会学术年会论文摘要汇编[C];2016年

9 陈军丽;常徽;彭晓莉;顾业芸;易龙;张乾勇;朱俊东;糜漫天;;3,6-DHF通过调控Notch信号通路调控乳腺癌细胞EMT[A];2017中国营养医学发展论坛暨全军营养医学大会论文汇编[C];2017年

10 郭占鹏;房师强;袁亚江;梅晰凡;;补阳还五汤协同同种肌源性干细胞改善急脊髓损伤模型的实验研究[A];第十九届全国中西医结合骨伤科学术研讨会论文汇编[C];2012年

相关博士学位论文 前10条

1 杨程;Notch信号通路介导小胶质细胞激活在米诺环素对糖尿病神经病理性痛的保护作用机制研究[D];天津医科大学;2017年

2 胡碧丹;Notch信号通路及其抑制剂在耐药非小细胞肺癌治疗中的影响和机制探讨[D];安徽医科大学;2018年

3 傅沈康;艾灸对围绝经期抑郁症大鼠海马神经发生及Notch信号通路的作用机制[D];辽宁中医药大学;2017年

4 李纯璞;乏氧环境下Notch信号通路在骨肉瘤耐药中的作用及机制研究[D];山东大学;2018年

5 宋宝全;人间充质干细胞成脂分化调控机制的研究[D];北京协和医学院;2016年

6 姚琳丽;Notch信号通路对小胶质细胞激活的作用及机制研究[D];山东大学;2016年

7 刘欢;叶酸调控神经干细胞增殖分化和凋亡对脑梗死大鼠的神经保护作用机制研究[D];天津医科大学;2011年

8 苏艳军;人干扰素-α2b基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗肝癌的实验研究[D];昆明医科大学;2016年

9 钟丽霞;白藜芦醇抗卵巢癌分子机制的研究[D];大连医科大学;2015年

10 刘华;茶多酚对高尿酸血症模型大鼠肾内血管损伤的干预机制研究[D];中南大学;2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 张珊;基于Notch信号通路探讨穿龙薯蓣皂苷治疗再生障碍性贫血疗效及机制研究[D];天津医科大学;2019年

2 叶强;艾灸“足三里”对化疗后骨髓抑制小鼠骨髓细胞中Notch信号通路影响的实验研究[D];甘肃中医药大学;2019年

3 洪梅;SNW1通过与RBPJ相互作用调节神经母细胞瘤Notch信号通路的机制研究[D];华中科技大学;2019年

4 郑雪媚;降钙素基因相关肽调控Notch信号通路与高氧致AECⅡ损伤修复的相关性研究[D];南华大学;2019年

5 杨艳霞;外源性硫化氢对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织Notch信号通路的影响[D];南华大学;2019年

6 刘波;苦碟子对脑缺血再灌注损伤火毒证大鼠缺血半暗带Notch信号通路的影响[D];北京中医药大学;2019年

7 杨蕊萍;HGF调控Notch信号通路抑制人血管内皮细胞内皮-间充质转化机制的实验研究[D];西南医科大学;2019年

8 吴玉雁;ZMIZ1基因通过调控Notch信号通路影响舌鳞状细胞癌的侵袭转移[D];兰州大学;2019年

9 汪国敏;清化固肾排毒方对UUO模型TGF-β1和Notch信号通路的影响[D];浙江中医药大学;2018年

10 张滕飞;基于Notch信号通路探讨中风膏对大鼠脑缺血损伤NGF表达及再生的作用[D];甘肃中医药大学;2018年

本文编号：2637995