人血清microRNAs作为脑卒中后认知功能障碍生物标志物的研究

发布时间：2020-04-23 22:09

【摘要】：目的:该项研究主要应用高通量的Solexa测序方法筛选出人脑卒中后认知功能障碍组(Post-stroke Cognitive Impairment,PSCI)、脑卒中后认知功能正常组(Post-stroke Cognitive Normality,PSCN)、年龄匹配对照组(Age-matched Controls,AMC)3组间显著差异表达的血清microRNAs(miRNAs),并通过实时荧光定量PCR进行验证。同时通过蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment,MoCA)对以上人群进行认知功能评定,以探讨这显著差异表达的miRNAs与脑卒中后认知功能障碍的相关性,从而判断其是否可为卒中后认知障碍早期诊断、早期干预的客观依据。方法:本研究招募了 PSCI组、PSCN组以及AMC组各40例,三组间年龄、性别、受教育年限、基础疾病相匹配,另外PSCI组、PSCN组间卒中类型、病灶、病程、脑卒中损伤程度相匹配。第一阶段:分别从PSCI组、PSCN组以及AMC组血清标本中,各选取5例血清标本,三组间年龄、性别、受教育年限、基础疾病相匹配,另外PSCI组、PSCN组间卒中类型、病灶、病程、脑卒中损伤程度相匹配。进行高通量的Solexa测序,初步筛选出PSCI组、PSCN组、AMC组间显著差异表达miRNAs。第二阶段:根据高通量的Solexa测序结果进行大规模、二阶段精确的定量验证,采用qRT-PCR检测三组血清中初筛选出的显著差异表达的miRNAs,并使用2-△Ct法计算其相对表达水平。为了探讨筛选的显著差异表达的miRNAs与脑卒中后认知功能障碍的相关性,本研究采用了 Spearman相关分析对血清中显著差异表达的miRNAs相对表达水平与MoCA评分进行了相关性分析。为了检验差异表达的miRNAs对脑卒中后认知功能障碍的预测价值,本研究进一步采用了 ROC(receiver operating characteristic,ROC)曲线及曲线下面积(areaundercurve,AUC)进行分析。结果:通过高通量的Solexa测序技术筛选及qRT-PCR验证过程,我们得到6个PSCI组与 PSCN 组、AMC 组间显著差异表达的血清 miRNAs:hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-93-5p、miR-5991-y。其中 hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-93-5p、miR-5991-y 在 PSCI 患者血清中呈显著上调状态(P0.05),hsa-miR-193b-5p在PSCI患者血清中呈显著下调状态(P0.05)。本研究运用Spearman相关分析发现MoCA评分与血清hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、miR-5991-y、hsa-miR-93-5p 的相对表达量间存在较强正相关(P0.05),与血清hsa-miR-193b-5p的相对表达量间存在较强负相关(P0.05)。进一步构建ROC曲线并得到 AUC(95%CI),结果如下:hsa-miR-193b-5p、miR-5991-y、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-191-5p 的 AUC 分别为 0.905、0.817、0.751、0.741、0.650、0.642(P0.01)。灵敏度、特异度分别为 hsa-miR-193b-5p(100%、85.7%)、miR-5991-y(77.5%、80.0%)、hsa-miR-20a-5p(63.2%、66.7%)、hsa-miR-93-5p(64.1%、62.2%)、hsa-miR-20b-5p(65.0%、57.0%)、hsa-miR-191-5p(58.5%、60.5%)。结论:1、通过高通量的Solexa测序技术的筛选及qRT-PCR验证过程,得到6个显著差异表达的血清miRNAs,其中hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-93-5p、miR-5991-y在PSCI患者血清中呈显著上调状态,has-miR-193b-5p在PSCI患者血清中呈显著下调状态。2、血清 hsa-miR-191-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、miR-5991-y、hsa-miR-93-5p表达水平越高,hsa-miR-193b-5p表达水平越低,提示脑卒中后发生认知功能障碍的可能性越大。3、血清miRNAs检测操作简单方便,而且无创,作为卒中后认知功能障碍早期诊断与预后的生物标志物具有潜在的应用价值。
【图文】：

Ａ荧光定量ＰＣＲ检测试剂盒（型号：ＭＲ１０１－０２）逦南京诺唯赞生物科技有限公司逡逑、无水乙醇逦国药集团化学试剂有限公司逡逑引物逦上海铂尚生物技术有限公司逡逑ｓｅ－Ｆｒｅｅ邋ｗａｔｅｒ逦南京诺唯赞生物科技有限公司逡逑０邋１＾１、１－２００邋ｐｉ、１００－１０００邋吸嘴（ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ）逦美国邋Ｋｉｒｇｅｎ邋公司逡逑ｌ微量离心管（ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ）逦美国Ｋｉｒｇｅｎ公司逡逑］邋ＰＣＲ邋管（ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ）逦美国邋Ｋｉｒｇｅｎ邋公司逡逑ｌ八联排管（ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ）逦美国Ｋｉｒｇｅｎ公司逡逑实验方法逡逑邋Ｓｏｌｅｘａ高通量测序逡逑别从ＰＳＣＩ组、ＰＳＣＮ组以及ＡＭＣ组血清标本中，各选取５个血清标本，三组逡逑、性别、受教育年限、基础疾病相匹配，另外ＰＳＣＩ组、ＰＳＣＮ组间脑卒中类型、逡逑位、病程、脑卒中损伤程度相匹配。将标本埋于干冰送往广州市基迪奥生物有限逡逑行高通量的Ｓｏｌｅｘａ测序，，具体步骤见图１－１、图１－２。逡逑

间年龄、性别、受教育年限、基础疾病相匹配，另外ＰＳＣＩ组、ＰＳＣＮ组间脑卒中类型、逡逑发病部位、病程、脑卒中损伤程度相匹配。将标本埋于干冰送往广州市基迪奥生物有限逡逑公司进行高通量的Ｓｏｌｅｘａ测序，具体步骤见图１－１、图１－２。逡逑Ｓｍａｌｌ邋ＲＮＡ逦Ｌｅｎｇｔｈ逡逑５，邋Ｐｆ－ｒ邋？攀■ｉＴ－ｒ邋＿邋Ｉ邋Ｉ邋■－ｒｒｒＴ邋Ｔｉ－ｒｏＨ逦１０－３０邋ｎｔ逡逑３＇邋ａｄａｐｔｏｒ邋ｌｉｂａｔｉｏｎ逡逑５．邋Ｐ邋＿邋＿邋逦逦＾邋３＇ａａａｐ，ｃ＂邋３６－５０邋ｎｔ逡逑５＇－ａｄａｐｔｏｒ邋ｌｉｇａｔｉｏｎ邋Ｉ逦１４－ｋｍａｉ－ｊ？此逡逑ｆｌＴｆｎ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｍ邋ｌ邋ｌ邋ｌ邋ｌ邋Ｉ邋逦逦逦逦Ｐ＇逦６２－７５邋ｎｔ逡逑Ｔ４－ＲＮＡ逦ｊ逡逑＾＞￣逦＾逦３逦３．l挘洌洌穑簦铮蝈义希蝈澹翦危忮邋五五五澹殄澹殄澹翦澹礤澹颍蝈五义希慑危遥藻澹穑颍椋恚澹蝈义希慑澹遥澹觯澹颍螅邋澹簦颍幔睿螅悖颍椋穑簦椋铮铄义希悖模危铃澹翦义希停湾澹慑澹慑澹慑濉鲥澹湾澹慑濉鲥澹慑濉鲥澹慑濉鲥澹慑澹慑澹慑濉鲥澹慑澹慑澹慑澹殄义希担撸妫洌幔穑

本文编号：2638202