FRK激活STAT1对脑胶质瘤细胞生长作用的研究

发布时间：2020-04-28 20:17

【摘要】：研究背景脑胶质瘤(glioma)是颅内最常见、致死性的原发恶性肿瘤。即便行手术及术后正规的放化疗,胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)患者的中位生存期仅14个月,5年死亡率高达95%。胶质瘤的发生和发展是一个需要细胞粘附,迁移、增殖和血管生成等多重渐进的过程。研究调控胶质瘤进程的分子机制及重要靶点,有助于开发新的有效治疗策略。目前的研究发现信号转导和转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STATs)家族在脑胶质瘤中发挥着重要作用。STATs蛋白的酪氨酸位点磷酸化是激活STAT信号通路级联反应的关键环节。我们前期研究发现FRK(Fyn-related kinase)基因,即蛋白酪氨酸激酶5(protein tyrosine kinase 5,PTK5),在脑胶质瘤的发生、发展中扮演着抑癌因子的角色。本课题旨在研究FRK在STATs激活途径中的作用及对脑胶质瘤生长作用的影响。研究方法1.通过慢病毒技术构建稳定表达FRK的U251与U87胶质瘤细胞系;通过蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测过表达FRK对胶质瘤细胞中STAT信号通路相关蛋白的影响;应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术设计FRK-siRNAs,通过脂质体法瞬时转染U251与U87细胞,下调FRK的表达水平,通过WB法检测FRK下调对胶质瘤细胞中STAT信号通路相关蛋白的影响。2.应用JAK2的特异性抑制剂AG490处理稳定表达FRK的U251与U87细胞,通过WB法检测磷酸化的JAK2(p-JAK2)、磷酸化的STAT1(p-STAT1)等蛋白的变化情况。3.应用STAT1的特异性抑制剂氟达拉滨(Fludarabine,Flu)处理稳定表达FRK的U251或U87细胞,通过免疫共沉淀法(CO-IP)检测FRK与STAT1的内外源结合情况。4.应用Flu处理稳定表达FRK的U251细胞,通过细胞免疫荧光法观察FRK对p-STAT1亚细胞定位的影响,通过WB法检测FRK过表达对STAT1下游靶基因表达的影响。5.应用脂质体法瞬时转染STAT1质粒,通过CCK8或Edu细胞增殖方法检测过表达STAT1对U251或U87细胞增殖的影响;应用脂质体法瞬时转染siRNA-STAT1,通过CCK8或Edu细胞增殖方法检测STAT1下调对U251或U87细胞增殖的影响。6.在稳定表达FRK的U251或U87细胞中,应用脂质体法瞬时转染siRNA-STAT1,通过CCK8或Edu细胞增殖方法检测STAT1是否参与FRK对胶质瘤细胞的生长抑制作用。7.应用WB法或免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC),检测FRK与STAT1在非肿瘤脑组织与各级别胶质瘤中的表达情况及相关性。8.将过表达FRK的U87细胞,通过立体定向注射技术,植入裸鼠右侧纹状体,构建裸鼠的脑胶质瘤原位移植模型。通过分析裸鼠生存时间与计算肿瘤体积等,评估FRK对在体胶质瘤生长的影响;通过Ki67组织免疫荧法,检测FRK对胶质瘤细胞增殖的影响;通过Cleaved caspase3组织免疫荧光法,检测FRK对胶质瘤细胞凋亡的影响;研究结果1.我们成功构建了稳定过表达FRK的U251及U87细胞。FRK过表达明显上调了p-JAK2与p-STAT1的蛋白表达水平,然而对STAT3的磷酸化水平无明显影响。FRK的下调抑制了p-JAK2与p-STAT1的蛋白表达水平,但是依然对STAT3的活化没有影响。2.用AG490去处理FRK过表达的U251细胞,结果显示JAK2的磷酸化水平明显被抑制,但FRK诱导的STAT1的磷酸化水平上调并没有明显改变。3.免疫共沉淀结果显示,FRK与STAT1内外源均可以结合形成蛋白复合体。用Flu处理过表达的U251细胞,FRK与STAT1的结合量明显减少。4.细胞免疫荧光结果显示,FRK过表达的U251细胞显示出明显的p-STAT1总量及核聚集增多现象,而Flu处理过表达FRK的U251细胞后,p-STAT1的入核量明显减少。WB结果显示,FRK过表达促进了Bax的蛋白表达,抑制了Bcl-2的表达。应用Flu处理过表达FRK的U251细胞后,取消了Bax的增多现象,同时Bcl-2抑制效应也被逆转。5.CCK8与EdU细胞增殖实验结果显示,STAT1过表达可以明显抑制脑胶质瘤细胞的增殖。相反,下调STAT1可以促进脑胶质瘤细胞的增殖。6.CCK8与EdU细胞增殖实验结果显示,在FRK过表达情况下,STAT1的下调部分促进了胶质瘤U251和U87细胞的增殖。7.WB与IHC实验结果显示,人脑胶质瘤组织中FRK与p-STAT1均明显低于非肿瘤脑组织,并且随着胶质瘤恶性级别升高而呈降低趋势,FRK与p-STAT1蛋白之间的表达成正相关性。8.裸鼠脑胶质瘤原位移植模型构建成功,生存曲线结果显示,FRK过表达组的裸鼠生存时间明显延长,HE染色结果显示肿瘤的体积也明显缩小。细胞免疫荧光结果显示,FRK过表达组Ki67阳性率明显降低,Cleaved caspase3阳性率明显增高。研究结论1.FRK可以促进JAK2与STAT1的活化,但不能激活STAT3。FRK诱导的STAT1的活化可能不依赖于JAK2。2.FRK可以与STAT1结合形成蛋白复合体,促进STAT1的核移位,参与调控Bcl-2与Bax等STAT1靶基因的表达。3.STAT1可以抑制脑胶质瘤细胞的增殖,并且参与介导FRK对脑胶质瘤的生长抑制作用。4.FRK与p-STAT1均在脑胶质瘤组织中低表达,呈正相关关系。5.裸鼠在体实验,FRK可以抑制脑胶质瘤的生长,延长裸鼠的生存时间。
【图文】：

信号通路,过表达

二、结果1．研究 FRK 对 STAT 信号通路的影响胶质瘤中 FRK 激酶与 STAT 信号通路的相关性还没未见报道。我们试着去研究 FRK 是否参与了 STAT 信号通路。我们选择 U251 与 U87 胶质瘤细胞系进行体外细胞实验。带有 EGFP 标签的 FRK 质粒通过慢病毒包装侵染细胞，形成稳定表达 FRK 的 U251 或 U87 细胞系。通过 WB 方法检测到脑胶质瘤 U251、U87 细胞中 FRK 的蛋白表达明显升高(图 1A-B, ***P < 0.001)。然后我们检测了 FRK 过表达的 U251、U87 细胞中 JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3与 p-STAT3 等蛋白的变化情况。如图 1C-E 结果显示 FRK 过表达明显上调了p-JAK2 与 p-STAT1 的蛋白水平(**P < 0.01, ***P < 0.001)，然而对 STAT3 的磷酸化水平无明显影响(N.S.，P＞0.05)。

磷酸化,信号通路,应用统计学,小干扰

南京医科大学博士学位论文STAT1、 p-STAT1、STAT3、p-STAT3 与 FRK 等蛋白的变化情况。(I-J) 应用统计学方法分析 H 图中 U251、U87 细胞的结果。**P < 0.01, ***P < 0.001。N.S.代表无明显统计学意义。进一步我们用RNA小干扰方法下调内源性FRK的水平，然后我们观察FRK敲除对 JAK/STAT 信号通路的影响。我们发现 FRK 蛋白在 U251、U87 细胞中被有效敲除大约 70-80% (图 1F-G, ***P < 0.001)。如图 1H-J 所示，FRK 的下调抑制了 p-JAK2 与 p-STAT1 的蛋白水平(***P < 0.001)，，但是依然对 STAT3 的活化没有影响(P＞0.05)。这些结果表明在胶质瘤细胞中 FRK 可能激活了JAK2/STAT1 信号通路，促进了 JAK2 与 STAT1 的活化。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.41

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