短暂性前脑缺血再灌注后大鼠海马脑区BDNF基因组蛋白乙酰化水平的研究

发布时间：2020-04-30 05:11

【摘要】：缺血性脑卒中是一个动态发展的过程。尽快恢复缺血区血液灌注是减轻脑损伤以及功能障碍最有效的方法。但是,由于缺血性脑卒中的突发性以及溶栓治疗的时间依赖性,临床上只有少数患者能够在时间窗内接受溶栓治疗,这严重影响脑卒中的治疗和预后。大脑是对缺血损伤最敏感的组织,海马脑区由于与学习、记忆和情绪密切相关,而备受关注。研究表明,大鼠在短暂性缺血再灌注(transient ischemic-reperfusion,I/R)后,海马神经元呈现不同的病理改变。缺血损伤会诱导CA1区出现迟发性锥体神经元死亡,而CA3区和DG区神经元则不受其影响,而且机制未明。大脑作为机体内最重要器官,具有多种自我保护机制,如抗氧化、抗兴奋毒性、抗凋亡和增强促存活基因的表达等。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作为神经营养素家族的一员,参与神经发生、神经元分化、神经元存活和突触可塑性等调节过程,并且与缺血脑损伤密切相关。但是,脑缺血后海马BDNF表达变化的机制仍不明确。本研究首先采用Puslinelli四血管夹闭法成功建立大鼠短暂性前脑缺血再灌注模型,通过与正常组和sham组相比评估缺血再灌注后海马各脑区BDNF蛋白以及mRNA表达的改变,并探讨其可能机制。结果发现,短暂性前脑缺血48h后,成年大鼠海马CA1区中BDNF蛋白表达降低,CA3和DG区的BDNF蛋白表达增加。缺血刺激可抑制海马脑区BDNF转录本IV在CA1中的表达,但增加了转录本I、IIc、III、IV、VI和X1在CA3和DG中的表达。然后通过ChIP研究发现,在BDNF的启动子1,2,4和6中,缺血导致CA1区H3K27ac水平降低,H3K9ac和H3K14ac水平升高;CA3区H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac水平升高;DG区组蛋白乙酰化水平无明显变化。上述实验结果表明,BDNF基因启动子区组蛋白的乙酰化模式,可能通过改变BDNF不同转录本的表达发挥调控海马脑区BDNF蛋白表达的作用,这将会为缺血性脑损伤的治疗提供新途径。第一部分短暂性前脑缺血再灌注对BDNF蛋白以及mRNA表达的影响目的:通过建立短暂性前脑缺血再灌注模型,与正常组和假手术组比较,观察BDNF蛋白及mRNA表达的变化。方法:1.实验分组:正常对照组(naive组),假手术组(sham组)和短暂性前脑缺血再灌注组(I/R组)。2.短暂性前脑缺血再灌注模型的制备:I/R组:雄性SD大鼠(240-260g),经戊巴比妥钠(5mg/100g,i.p.)麻醉后,经耳固定于立体定位仪上。电凝双侧椎动脉并分离双侧颈总动脉后,于术后第二日夹闭双侧颈总动脉15min后恢复灌注,造成短暂前脑缺血。sham组:除不电凝椎动脉,不夹闭颈总动脉之外,其余操作同I/R组。3.用Western Blot和RT-qPCR法检测不同分组海马各区的BDNF蛋白和mRNA相对表达水平。结果:1.Western Blot结果显示:与正常组相比较,sham组大鼠海马各分区BDNF相对表达量无统计学差异。与sham组相比,I/R组大鼠CA1区BDNF蛋白表达水平显著降低,CA3区和DG区BDNF蛋白水平在缺血后显著升高。2.RT-qPCR结果显示:与正常组相比较,sham组大鼠海马各分区BDNF mRNA相对表达量无统计学差异。与sham组相比,缺血再灌注后CA3区和DG区BDNF转录本I、IIc、III、IV、VI和X1表达均上调。缺血再灌注后CA1区BDNF转录本I、III、VI和X1表达上调,BDNF转录本IV下调,BDNF转录本IIc表达无统计学意义。结论:短暂性前脑缺血再灌注后,海马CA1区锥体神经元BDNF蛋白表达降,BDNF转录本IV表达降低;CA3区和DG区在缺血后BDNF蛋白表达升高,BDNF转录本I、IIc、III、IV、VI和X1表达升高。第二部分短暂性前脑缺血再灌注对BDNF启动子区域乙酰化水平的影响目的:组蛋白的不同修饰可以导致染色质重塑,从而调控基因表达。组蛋白乙酰化可以使得组蛋白和DNA间的相互作用减弱,导致染色质构象松散,这样的状态有助于转录调节因子接近并结合转录因子,进而促进基因转录。研究表明,组蛋白的乙酰化、甲基化和泛素化等修饰,可以调控BDNF蛋白表达,并与许多神经系统的疾病发生发展密切相关。因此我们推测,组蛋白乙酰化修饰可能在缺血再灌注后BDNF基因表达变化中发挥调控作用。本实验通过建立大鼠短暂性前脑缺血再灌注模型,与sham组比较,观察BDNF启动子区组蛋白H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac水平的变化。方法:1.实验分组:sham组,I/R组。2.采用Ch IP方法检测sham组和I/R组大鼠海马CA1,CA3和DG区的BDNF启动子1,2,4和6上的H3K9,H3K14和H3K27乙酰化水平的变化。结果:与sham组相比,I/R组BDNF基因启动子1,2,4,6区的H3K27ac的水平在CA1区降低,在CA3区升高。H3K9ac和H3K14ac水平在CA1区和CA3区均升高。在DG区,BDNF基因多个启动子区的H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac的水平无显著变化。结论:短暂性前脑缺血再灌注后,CA1区BDNF基因启动子区组蛋白低H3K27ac程度可能通过抑制BDNF转录本IV转录,降低BDNF蛋白表达;CA3区BDNF基因启动子区高H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac程度可能通过促进BDNF转录本I、IIc、III、IV、VI和X1转录,升高BDNF蛋白表达;DG区BDNF蛋白表达与启动子区H3K9ac,H3K14ac和H3K27ac程度无显著关系。
【图文】：

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山西医科大学硕士学位论文2 结果短暂性前脑缺血再灌注后大鼠海马脑区 BDNF 蛋白表达发生Western Blot 检测结果显示：与正常组大鼠相比，sham 组大鼠 CA1，CA3DNF 蛋白表达无统计学差异。和 sham 组相比，I/R 组大鼠 CA1 区 BDNF 平显著降低（P<0.001，，n=8），而 CA3 区（P<0.05，n=8）和 DG 区（P<表达水平升高，有统计学差异（图 1）。

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山西医科大学硕士学位论文2.2 短暂性前脑缺血再灌注对大鼠海马脑区 BDNFmRNA 表达的影响RT-qPCR 结果显示：与正常组相比，sham 组大鼠海马 BDNF mRNA 表达量无变化。与 sham 组相比，缺血再灌注组大鼠海马 CA3 和 DG 区 BDNF mRNA I、IIc、III、IV、VI 和 X1 表达均上调，有统计学意义（P<0.05，P<0.01 或 P<0.001，n=6）。缺血再灌注后CA1区BDNF mRNA I、III、VI和X1表达上调（P<0.05，P<0.01或P<0.001，n=6），BDNF mRNA IV 下调（P<0.05，n=6）。BDNF mRNA IIc 表达无统计学意义（图 2）。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.31

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