外源性β-羟丁酸的抗癫痫作用研究

发布时间：2020-05-03 19:15

【摘要】：癫痫是一种中枢神经系统功能失常的慢性疾病,具有反复发作的特征,可造成严重的家庭和社会负担。在我国,癫痫的患病率约为3.6%-4.4%,尤其以16岁以下的儿童和青少年居多。虽然多种抗癫痫药物相继问世,但至今仍有30%左右的癫痫难以用药物控制。因此,临床需要一种更有效的治疗癫痫的方法。生酮饮食在难治性癫痫中的治疗作用已被广泛接受。虽然其具体的作用机制至今未明,但大多数研究认为β-羟丁酸是监测生酮饮食抗癫痫效果的理想指标,也是生酮饮食发挥抗癫痫作用的主要物质。故作为酮体最重要的组成部分,β-羟丁酸的神经保护和抗癫痫作用成为研究的热点。目前已有研究证明,外源性β-羟丁酸的应用对部分癫痫模型和神经系统其他疾病有神经保护作用。β-羟丁酸可能会通过调节中枢系统的神经递质浓度,影响能量代谢和神经元膜电位,抑制凋亡和氧化毒性损伤,减少钙离子内流等机制发挥神经保护和抗癫痫作用。鉴于生酮饮食临床应用的局限性,外源性β-羟丁酸制剂可能会替代生酮饮食成为治疗难治性癫痫甚至其他神经系统疾病的新方向。本研究拟从以下三个部分研究外源性β-羟丁酸的抗癫痫作用。第一部分:外源性β-羟丁酸对体内β-羟丁酸及血糖含量的影响目的:研究外源性β-羟丁酸(beta-hydroxybutyrate,BHB)对体内BHB及血糖含量的影响。方法:1.32只雄性Wistar大鼠随机分为A(n=9),B(n=9),C(n=9),D(n=5)四个组,分别腹腔注射2mmol/kg,4mmol/kg,8mmol/kg的D,L-β-羟丁酸及4ml/kg的生理盐水。2.用乙醚麻醉大鼠,然后分别于注射BHB和生理盐水的第0 min,15 min,45 min,75 min和90 min,通过内眦静脉采血,获得约1mL血液。3.利用BHB检测试剂盒检测各个时间点大鼠血清中BHB的浓度。4.取20只Wistar大鼠,分为实验组和对照组,每组10只。实验组大鼠腹腔注射4 mmol/kg的BHB,对照组大鼠腹腔注射4ml/kg的生理盐水。5.分别于注射BHB和生理盐水的第0min,15 min,45 min,75 min和90 min,从大鼠尾端末梢采集血液样本,用罗氏血糖仪测定两组大鼠的血糖浓度。6.利用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。结果:1.外源性BHB能显著增加大鼠血清中BHB的浓度。在没有外源性BHB的作用下,血清中BHB的浓度约为0.57±0.01 mmol/L(各组间无显著差异)。在不同浓度外源性BHB作用15 min之后,血清中BHB的浓度增加至1.35-2.37 mmol/L,并且在接下来的75 min内,BHB的浓度一直维持在这一水平。同时,BHB作用组在所有时间点上的浓度要高于对照组。用2 mmol/kg,4 mmol/kg和8 mmol/kg BHB处理的各组之间,15 min时各组间无显著差异,45 min、75 min、90min时各组间比较均有显著差异。当用4mmol/kgBHB作用时,血清BHB的浓度相对稳定,与大鼠在用生酮饮食处理后的水平非常相似。2.外源性BHB对大鼠血糖浓度无显著影响。在注射4 mmol/kg BHB的15 min内,血糖浓度首先增加,然后在接下来的75 min之内,血糖浓度逐渐降低。然而,与对照组相比,血糖浓度的变化没有显著差异(p0.05)。此外,实验组大鼠在不同时间点之间的血糖浓度也没有显著差异(p0.05)。结论:1.外源性BHB能显著增加大鼠血清中BHB的浓度。2.向大鼠腹腔注射4 mmol/kg的BHB,15 min即可使大鼠体内BHB的浓度上升至与生酮饮食和饥饿时大鼠体内BHB浓度相当的水平。3.腹腔注射BHB对大鼠血糖水平无显著影响。第二部分:外源性β-羟丁酸对海人酸癫痫模型的保护作用目的:研究外源性BHB对海人酸诱导的癫痫模型的保护作用。方法:1.建立海人酸癫痫模型:用10 mg/kg的海人酸(kainic acid,KA)腹腔注射50只3周龄的雄性Wistar大鼠。注射KA 2 h后,根据Racine分级标准对动物的癫痫发作行为进行评价:0级,正常行为状态;Ⅰ级,出现面部肌肉抽搐及湿狗样颤动;Ⅱ级,以点头运动为主要表现的颈部肌肉抽搐;Ⅲ级,前肢的阵挛、抽搐;Ⅳ级,双侧前肢伸直,伴有身体的立起;V级,跌倒和全身惊厥。Ⅲ级以下为复杂部分发作,Ⅳ和Ⅴ级为全身强直阵挛发作。当大鼠癫痫状态持续超过90 min时,给予10%的水合氯醛(400 mg/kg)以解除痉挛。2.将50只3周龄雄性Wistar大鼠随机分为BHB+KA组和NS+KA组,每组25只,其中NS+KA组为对照组。各组分别做如下处理:BHB+KA组腹腔注射4mmol/kg的BHB,30 min后再注射10mg/kg的海人酸;NS+KA组腹腔注射4ml/kg的生理盐水,30 min后再注射10 mg/kg的海人酸。3.记录每只大鼠出现Ⅳ级及以上发作行为的时间,并计算每只大鼠出现Ⅳ级及以上发作行为的潜伏期。4.在注射KA后的2h内,持续记录第Ⅳ或Ⅴ级的癫痫的最高发作程度。5.利用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。结果:1.BHB对大鼠KA癫痫发作潜伏期有显著影响。通过对两组大鼠体重的比较发现,NS+KA组大鼠的平均体重(54.61±0.78 g)与BHB+KA组大鼠的平均体重(54.80±2.12 g)没有显著差异(p0.05)。进一步对两组大鼠出现Ⅳ级及以上癫痫发作行为的潜伏期进行比较,结果发现NS+KA组大鼠癫痫发作的潜伏期(63.31±4.050min)显著长于BHB+KA组大鼠癫痫发作的潜伏期(37.08±1.958min)(p0.05)。2.BHB对大鼠KA癫痫发作等级无显著影响。腹腔注射4 mmol/kg BHB和4 ml/kg生理盐水的两组大鼠,30 min内其行为均无任何异常表现。而在注射KA后两组均出现癫痫发作行为,并且NS+KA组大鼠癫痫发作的最高等级(4.67±0.098)稍高于BHB+KA组大鼠癫痫发作的最高等级(4.54±0.100),但两组间的差异不具有统计学意义(p0.05)。结论:在KA诱导的大鼠癫痫模型中,BHB可以延长癫痫发作的潜伏期,但不能降低癫痫发作的等级。第三部分:外源性β-羟丁酸的抗癫痫作用目的:研究并探讨外源性BHB的抗癫痫作用。方法:1.雄性Wistar大鼠分为BHB+KA,BHB,NS+KA和NS四个组,分别腹腔注射4 mmol/kg 的 BHB 和 10 mg/kg 的 KA,4 mmol/kg 的 BHB,4 ml/kg 的生理盐水和10 mg/kg的KA,4 ml/kg的生理盐水。2.在大鼠癫痫发作后第1、3、7和14天分批处死部分大鼠,取其脑组织,左侧制备石蜡切片,右侧剥离出海马组织,立即放入-80℃冰箱冷冻。3.使用尼氏染色试剂盒对大鼠海马组织石蜡切片进行尼氏染色,观察神经元的缺失情况。4.使用Timm组织化学染色,观察不同组中海马组织的形态及苔藓纤维发芽(MFS)情况。5.利用还原型谷胱甘肽(GSH)ELISA检测试剂盒测定海马组织中GSH的含量。6.利用Y-氨基丁酸(GABA)ELISA检测试剂盒测定海马组织中GABA的含量。7.利用三磷酸腺苷(ATP)ELISA检测试剂盒测定海马组织中ATP的含量。8.利用免疫荧光双标法观察神经特异性烯醇化酶(NSE)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。9.用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。结果:1.BHB能缓解KA引起的神经元损伤。在大鼠注射KA的第3天,通过尼氏染色法对大鼠海马组织进行染色,结果发现在NS和BHB组的大鼠,其海马体的海马区并没有发生神经损伤。然而,KA组大鼠的CA1和CA3区域呈现典型的神经元的缺失和损伤。与NS+KA组相比,BHB+KA组中神经元的缺失有所减少。通过检测大鼠海马组织中GSH、GABA和ATP的含量,发现BHB+KA组中大鼠海马组织的GSH和GABA的含量均有所回升,说明BHB对KA引起的大鼠海马神经元的损伤具有缓和作用。2.BHB能够缓解KA癫痫模型的MFS出芽情况。在大鼠注射KA的第14天,通过Timm组织化学染色的方法对大鼠海马进行染色,结果发现NS+KA组大鼠的平均Timm评分要显著高于NS组、BHB组和 BHB+KA 组。而 NS 组(0.13±0.06)和 BHB 组(0.23±0.06)的 Timm 染色评分结果比较没有统计学差异(p0.05)。BHB+KA组(1.5±0.50)的Timm染色平均评分要显著低于NS+KA组(3.67±0.15)(p0.05)。表明在接受BHB预处理的KA癫痫模型中,MFS得到了缓解。3.BHB能减轻KA引起的神经元损伤及星形胶质细胞的代偿性增生。在大鼠注射KA的第3和第7天,与NS组相比,NS+KA组中神经元的数量有所减少,而星形胶质细胞的数量显著增多。我们推测可能是KA引起神经元的损伤,导致神经元数量减少,星形胶质细胞代偿性增生。与NS+KA组相比,BHB+KA组神经元数量有所增多,而星形胶质细胞的数量有所减少。说明BHB能减轻神经元的损伤及星形胶质细胞的代偿性增生。结论:BHB能缓解KA引起的大鼠海马神经元的损伤。
【图文】：

外源性,血糖浓度,丁酸,显著影响

（二）外源性ＢＨＢ对大鼠血糖浓度的影响逡逑本研宄利用罗氏血糖仪对实验组（注射４邋ｍｍｏｌ／ｋｇ的ＢＨＢ）和对照组（注逡逑射４邋ｍｌ／ｋｇ的生理盐水）中大鼠的血糖浓度进行测定，结果如图２所示。研宄发逡逑现，在注射４邋ｍｍｏｌ／ｋｇ邋ＢＨＢ的１５邋ｍｉｎ内，血糖浓度首先上升，然后在接下来的逡逑７５邋ｍｉｎ之内，血糖浓度逐渐下降。然而，与对照组相比，血糖浓度的变化没有显逡逑著差异（表２）。此外，研宄还发现实验组大鼠在不同时间点之间的血糖浓度也逡逑没有显著差异（表２），这也说明注射４邋ｍｍｏｌ／ｋｇ的ＢＨＢ对机体血糖浓度无影逡逑响。逡逑安逦－ｍ－邋ＢＨＢ邋４ｍｍｏｌ／ｋｇ逡逑＾邋７－邋ｔ逦＂逦－Ａ－邋ＮＳ４ｍｌ／ｋｇ逡逑旦逦Ｔ逡逑？邋６－逡逑一＂■二＾逡逑ｙ邋４－逦ｉ逦Ｔ逡逑ｏ逡逑３逦！逦Ｊ逦Ｊ逦Ｊ逦｜逡逑０逦２０逦４０逦６０逦８０逦１００逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｍｉｎ）逡逑图２．外源性ｐ＃丁酸对大鼠血糖的浓度无显著影响逡逑ＢＨＢ，邋ｐ－羟丁酸。ＮＳ，生理盐水。逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ邋ＢＨＢ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｈａｄ邋ｎｏ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｎ邋ｂｌｏｏｄ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋ｌｅｖｅｌｓ．邋ＢＨＢ，逡逑ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ，邋ＫＤ，邋ｋｅｔｏｇｅｎｉｃ邋ｄｉｅｔ；邋ＮＳ，邋ｎｏｒｍａｌ邋ｓａｌｉｎｅ．逡逑１９逡逑

外源性,大鼠

逡逑结果如图３所示。研究发现ＮＳ＋ＫＡ组大鼠癫痫发作的潜伏期为３７．０８±１．９５８邋ｍｉｎ，逡逑ＢＨＢ＋ＫＡ组大鼠癫痫发作的潜伏期为６３．３１±４．０５０邋ｍｉｎ，两组大鼠癫痫发作的潜逡逑伏期差异显著（＊ｐ＜０．０５）。逡逑＾邋８0１邋＊逡逑旦逡逑６０－逡逑■逡逑＾邋４０－逡逑ｌ0－邋ｎ邋■逡逑＾邋0］逦逦逦逡逑图３．外源性ＢＨＢ延长了大鼠vr痫发作的潜伏期逡逑＊ｐ＜０．０５，与ＮＳ＋ＫＡ组相比。ＢＨＢ，卩－羟丁酸；ＫＡ，海人酸；ＮＳ，生理盐水。逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ邋ＢＨＢ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ邋ｔｈｅ邋ｏｎｓｅｔ邋ｔｉｍｅ邋ｏｆ邋ｓｅｉｚｕｒｅ．邋＊ｐ＜邋０．０５，逡逑ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ＮＳ＋ＫＡ邋ｇｒｏｕｐ．邋ＢＨＢ，邋Ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ，邋ＫＡ，邋ｋａｉｎｉｃ邋ａｃｉｄ，邋ＮＳ，邋ｎｏｒｍａｌ逡逑ｓａｌｉｎｅ．逡逑（二）ＢＨＢ对大鼠vq痫发作等级的影响逡逑本研宄发现ＢＨＢ＋ＫＡ组和ＮＳ＋ＫＡ组大鼠在注射ＫＡ后均出现癫痫发作行逡逑为，，对ＢＨＢ＋ＫＡ组和ＮＳ＋ＫＡ组大鼠癫痫发作等级进行比较，结果发现ＮＳ＋ＫＡ逡逑组大鼠vR病发作的最尚等级为４．６７±０．０９８，稍闻于ＢＨＢ＋ＫＡ组大鼠vR病发作的逡逑最局等级４．５４±０．１００，但两组大鼠vR痛发作的最尚等级无显著差异（图４
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.1

【参考文献】