CBD-IGF-1的制备及复合PLGA导管在神经损伤修复中的作用

发布时间：2020-05-05 08:22

【摘要】：周围神经损伤作为当前常见病,不同于其他组织损伤,其恢复过程较慢且常残留部分症状,仅有不到一半的神经损伤患者恢复了良好的感觉运动功能。神经损伤与修复是神经学科与组织工程领域交叉学科共同研究的重点,轴突定向再生是神经功能恢复的关键,神经导管在轴突的定向再生过程中起到了重要的作用。神经组织工程学热点材料PLGA因其组织相容性好、降解可控等优点被广泛使用,然而相较于自体神经移植,其在神经再生效率和功能恢复率上仍然较低。PLGA导管需要细胞粘附分子和神经营养因子等为神经再生提供更有利的微环境。IGF-1是一个含有70个氨基酸左右的单肽链,隶属于胰岛素家族,IGF-1对生长发育、神经细胞的增殖分化、创伤修复以及结构和功能整合具有重要的意义,在神经系统其可促进神经生成、突触形成、神经保护、促进增殖、抗凋亡等方面具有重要作用,同时其还有促进轴突再生和再髓鞘化的功能;然而半衰期短、容易扩散等缺点限制了其广泛应用。为了解决这些问题,我们将来源于胶原酶的胶原结合基团(CBD)融合到人类IGF-1上,由于胶原广泛存在,CBD可以增强药物在受损区域滞留时间;同时将I型胶原交联到PLGA导管上,作为细胞粘附分子增强导管的细胞粘附性,也为CBD-IGF-1提供靶向结合位点。目的将来源于胶原酶的胶原结合基团(CBD)融合到人类IGF-1上,克服半衰期短、容易扩散等缺点,结合神经组织工程学为周围神经损伤提供新的治疗方式。方法将来自于胶原酶的胶原结合基团的基因序列与人类胰岛素样生长因子1基因通过全基因合成方式融合,构建重组质粒p ET-15b,然后转染到大肠杆菌内部进行表达,经过分离、纯化、复性,获得改良的胰岛素样生长因子1,进而行Western blot定性鉴定、胶原绑定能力测试、促进细胞增殖能力测试、促进细胞神经向分化测试、促进其它因子合成测试等细胞实验;制作搭载胶原及CBD-IGF-1的复合PLGA导管,然后通过坐骨神经缺损模型验证复合导管对神经损伤修复的促进作用结果运用基因工程技术、原核表达系统成功获得重组蛋白CBD-IGF-1,经过SDS电泳及Western blot定性鉴定,确认重组蛋白为CBD-IGF-1。胶原绑定能力测试结果显示,CBD-IGF-1的胶原绑定能力明显优于IGF-1(p0.05),并且随着浓度升高,这种胶原结合率更高;促细胞增殖能力测试,CBD-IGF-1能有效促进施旺细胞和PC12细胞增殖,不同于IGF-1在较低浓度出现毒性浓度,其在1000ng/ml内均能有效促进细胞增殖;促进PC12细胞神经向分化方面CBD-IGF-1与IGF-1均能促进细胞分化,且两者在促分化能力方面无统计学差异(p0.05);CBD-IGF-1能促进施旺细胞表达IGF-1受体及NGF,抑制PC12细胞合成Nogo-A蛋白,与IGF-1相比其能力在干预初期不及IGF-1出现效果快,但是能稳定持久保持刺激作用(p0.05)。成功制备PLGA导管,搭载胶原及CBD-IGF-1后表征分析提示,PLGA搭载胶原及CBD-IGF-1后接触角明显降低,亲水性增强(p0.05);成功构建大鼠坐骨神经缺损5mm模型后,使用搭载胶原及CBD-IGF-1的PLGA导管桥接神经断端,术后步态分析结果、电生理学、坐骨神经及腓肠肌组织病理学切片均提示PLGA搭载胶原及CBD-IGF-1能有效促进神经再生,同时与PLGA搭载胶原及IGF-1相比,CBD-IGF-1更能促进神经再生(p0.05)。结论1.通过基因重组和原核表达系统可以成功构建并表达合成CBD-IGF-1。2.CBD-IGF-1具备较强的胶原绑定能力;能有效促进施旺细胞和PC12细胞增殖;能促进PC12细胞向神经细胞分化;能促进施旺细胞合成IGF-1受体和NGF;能抑制PC12细胞表达Nogo-A蛋白。3.CBD-IGF-1在体内具有良好的促进神经再生功能。4.PLGA导管搭载胶原及CBD-IGF-1是促进神经再生的有效组合。创新点1.通过基因工程将来源于胶原酶的胶原结合基团(CBD)融合到人类IGF-1上,增强了IGF-1的胶原绑定能力和稳定性,优化了IGF-1的生物学性能。2.PLGA导管搭载胶原及CBD-IGF-1可作为良好的神经组织工程学材料。
【图文】：

热水浴,箭头,热休克,铺板

32图 2.1 pET-15b CBD-IGF-1 载体构建图红色箭头为目标片段，黑色箭头为限制性内切酶位点。3）在融化的感受态细胞中加入 2ul 质粒，轻轻晃动摇匀，在冰面放置 20 分钟。4）在 42℃热水浴中热休克 45 秒，迅速将 EPP 管放置到冰面上 2 分钟。5）再加入 950ul 已预热到室温的 LB 培养基，并放置于 37℃恒温摇床孵育 1.5小时（速度 150 rpm）。6）吸取 100ul 转染后细胞，铺板到含有 100ug/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上，干

摇床,染色液,分离纯化,凝胶

图 2.2 CBD-IGF-1 分离纯化蛋白液电泳染色：将凝胶浸泡在染色液中，摇床染色 4 小时。脱色：染色结束后将凝胶浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间更换脱色液 3 次。拍片：用凝胶成像仪拍片。5）经过电泳初步鉴定合成蛋白分子量在 5-10kD 之间，将蛋白液进行下一步分离纯化，利用 Ni-NTA 采用 PH 梯度洗脱，使用 dissolve buffer 调节 PH 值依次为 6.5、5.5、4.5 进行洗脱，每次洗脱液行电泳检测。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R745

【参考文献】