食欲素B对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用的实验研究

发布时间：2020-05-06 09:58

【摘要】：背景:脑卒中是目前威胁人类健康的重要脑血管疾病之一,尤其以缺血性脑卒中最为多见,在全世界范围内有着较高的致残率和死亡率。到目前为止,早期静脉溶栓治疗和血管内治疗是临床实践中较为有效的治疗方式,但缺血再灌注引起的继发性神经损伤明显影响着患者预后的恢复,对溶栓或机械取栓的推广应用在理论和实践上具有不同意见。目前研究表明脑缺血再灌注后继发性神经损伤与内质网应激、炎症反应、能量代谢、兴奋性氨基酸等有着密切关系。因此,针对缺血后再灌注损伤过程中神经保护的研究,有可能为治疗缺血性脑卒中提供新的有效途径。食欲素B作为G蛋白偶联受体的内源性配体,是主要由下丘脑分泌的一种神经肽。已有研究表明食欲素B能够抑制多巴胺神经元自发程序性死亡,从而起到神经保护作用,但是食欲素B是否参与脑缺血再灌注后的神经损伤的病理生理过程,其可能的作用机制值得进一步研究。目的:建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,观察食欲素B(Orexin-B,OXB)对脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用,并初步探讨其神经保护的可能机制。方法:选用Wistar健康雄性大鼠,体重200g～230g。采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occulusion,MCAO)模型,于脑缺血2h后缓慢拔出线栓进行再灌注24h。首先采用ELISA技术检测不同时间点模型大鼠血清中内源性Orexin-B变化。将大鼠随机分为假手术组(Control)、缺血再灌注组(I/R)、缺血再灌注+PBS组(I/R+PBS)和缺血再灌注+Orexin-B组(I/R+OXB),对模型组大鼠采用改良的Zea-Longa5级神经行为学评分法评分,实验过程中,对于手术中出血过多、出现呼吸困难、造模不成功、死亡的动物均应排除,并采取随机抽样原则补齐,并重新造模纳入。I/R+PBS组造模成功的大鼠在再灌注早期(20min)向侧脑室内注射10μl PBS缓冲盐溶液,I/R+OXB组造模成功的大鼠在再灌注早期注射10μl的Orexin-B,Orexin-B的浓度根据预实验结果确定为1μg/μl。采用TTC染色法测定大鼠脑梗死体积;采用免疫组化检测大鼠皮层梗死区域及OX2R阳性细胞区域变化情况;通过免疫蛋白印迹法检测大鼠海马区食欲素2型受体(OX2R)、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达情况;采取不同时间点对各组大鼠进行Zea-Longa法评分,观察不同时间点大鼠神经功能缺损症状的改变;采取跳台实验检测各组大鼠学习与记忆的改变。结果:内源性食欲素B在缺血2h内增加,恢复再灌注随后内源性食欲素维持相对稳定;食欲素B治疗组能明显减轻大鼠梗死体积,OX2R染色阳性细胞区域较损伤组增大;I/R组、I/R+PBS海马中OX2R及p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达较假手术组减少(p0.05),而I/R+OXB组上述变化明显减轻(p0.05);I/R+OXB组脑梗死体积明显减少;I/R组潜伏期时间减少,错误次数增多(p0.05),而I/R+OXB组上述变化显著减小(p0.05)。结论:食欲素B在脑缺血再灌注损伤中具有明显的神经保护作用,其作用机制可能与促进OX2R表达,增强p-AKT活性,使磷酸化GSK-3β增多,发挥促进神经元生存,抑制神经元凋亡有关。本研究对食欲素B神经保护作用的理论研究提供详细的数据支持。同时,对于缺血性脑中风的治疗和相关临床药物开发提供新的思路,具有潜在的应用推广价值。
【图文】：

大鼠,前囟,切口,麻醉剂

术后２ｈ后拔出线栓，评估大鼠麻醉状态，用止血钳钳夹大鼠后肢或尾部无应激逡逑反应，若大鼠有苏醒反应，补充少量麻醉剂，整个实验过程均需遵循无菌原则。将逡逑麻醉好的大鼠常规碘伏消毒、备皮后固定于三维脑立体定位仪（图２－２），，取大鼠逡逑两耳中点沿矢状线切开约１．２？１．５ｃｍ长的切口，用手术刀柄钝性分离并尽量清理切逡逑口周围的皮下组织用直径约为３？４ｍｍ的小棉球蘸取３％的Ｈ２０２消化切口周围的肌逡逑肉、结缔组织等并用医用眼科剪剪除消化后的组织，直至颅骨前囟充分暴露。参考逡逑大鼠脑立体定位图谱（Ｆａｎｋｌｉｎ邋ａｎｄＰａｘｉｎｏｓ）和本研宄所既往的研究，定位时先以大鼠逡逑前囟的十字交叉点为参照点并标记，然后在该点后即前囟后（ＡＰ）邋０．８ｍｍ、左侧旁逡逑开（Ｌ）邋１．６＿处进行标记并用颅骨钻在大鼠颅骨表面钻取直径约１．０ｍｍ的小孔（有逡逑１３逡逑

立体定位仪,留针,合线,侧脑室注射

山东大学硕士学位论文逡逑度，否则易致较大量出血，此时用医用棉球压迫渗血，再用微量注射器分别吸取食欲素Ｂ或ＰＢＳ室中缓慢注射（１０／ｍｉｎ），注射完毕后再留针５？ｌ胶海绵覆盖针孔，以防止注射物和脑脊液流出。合线缝合皮肤，再次消毒创口处。侧脑室注射过，直至大鼠苏醒。逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3

【参考文献】