Salsolinol合成酶的克隆表达及其生物功能的研究

发布时间：2017-03-24 06:02

  本文关键词：Salsolinol合成酶的克隆表达及其生物功能的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种常见于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，研究发现生物体内存在一类由多巴胺（Dopamine，DA）衍生而来的MPTP结构类似物——儿茶酚异喹啉类物质(CAIQs)。Salsolinol（6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉，Sal）作为一种能在人脑和尿液中检测到的内源性儿茶酚异喹啉类物质，在一定条件下，它及其衍生物能引起多巴胺能神经元的死亡从而参与PD致病过程。Sal合成酶（Salsolinol synthase）是儿茶酚异喹啉类物质合成代谢过程中的首个关键酶，，它是一种催化多巴胺和乙醛生成多巴胺能神经毒性物质Salsolinol的酶，直接影响到Sal及其衍生物在体内的代谢过程。 研究证实Sal合成酶存在于鼠脑中，通过对纯化的Sal合成酶进行氨基酸序列分析获得其氨基酸序列。研究发现Sal合成酶氨基酸序列与泛素有94.8%的相似性，由此可通对泛素基因定点突变获取Sal合成酶基因。本文采用PCR技术扩增Sal合成酶基因，将其连接到原核载体pET28a和真核表达载体pcDNA4上，获得重组质粒，并将其转化到大肠杆菌BL21和真核HEK细胞中。Sal合成酶基因在细菌和细胞内大量表达，SDS-PAGE电泳结果及Western-blot显示出分子量约为12KD特异性蛋白质条带，与Salsolinol合成酶蛋白分子量大小一致。经亲和层析分离得到纯化的Salsolinol合成酶蛋白。通过三重四级杆串联质谱检测Sal合成酶的催化活性，结果表明过量表达的Sal合成酶体现出较高的活性，证明前期获得的蛋白基因所表达的蛋白具有Sal合成酶活性。
【关键词】：帕金森病 Salsolinol合成酶 克隆和表达 纯化 酶活
【学位授予单位】：北京理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-24
• 1.1 帕金森病简介11-15
• 1.1.1 临床症状及病理特征11
• 1.1.2 帕金森病病因11-12
• 1.1.3 帕金森病发病机制12-15
• 1.2 氧化应激影响内源性神经毒素儿茶酚异喹啉类物质形成的假说15-17
• 1.3 Sal 的生物合成及神经毒性17-20
• 1.3.1 Sal 的生物合成17-18
• 1.3.2 Sal 及其衍生物的神经毒性18-20
• 1.4 Sal 合成酶及其相关研究现状20-22
• 1.4.1 Pictet-Spengler 酶20
• 1.4.2 Sal 合成酶20-22
• 1.5 本课题研究的意义与目的22-24
• 第2章 实验部分24-47
• 2.1 实验试剂与仪器24-26
• 2.1.1 试剂24
• 2.1.2 菌株和质粒24
• 2.1.3 试剂配置24-25
• 2.1.4 实验仪器25-26
• 2.2 Sal 合成酶稳定表达体系的建立26-36
• 2.2.1 Sal 合成酶基因的获取26-28
• 2.2.2 原核表达体系的构建28-33
• 2.2.3 真核表达体系的构建33-36
• 2.3 Sal 合成酶的表达及纯化36-44
• 2.3.1 原核表达体系蛋白表达36
• 2.3.2 真核表达体系蛋白表达36-38
• 2.3.3 表达蛋白 Sal 合成酶的验证38-42
• 2.3.4 Sal 合成酶的分离和纯化42-44
• 2.4 Sal 合成酶酶活测定44-47
• 2.4.1 Sal 合成酶反应体系及反应条件44-45
• 2.4.2 Sal 催化产物 Sal 的 LC-ESI-QQQ 检测方法45-47
• 第3章 结果与讨论47-57
• 3.1 Sal 合成酶基因克隆47-50
• 3.1.1 定点突变47-48
• 3.1.2 Sal 合成酶基因扩增48
• 3.1.3 重组质粒的构建与分析48-49
• 3.1.4 基因测序与序列分析49-50
• 3.2 Sal 合成酶的表达与纯化50-54
• 3.2.1 诱导表达融合蛋白50
• 3.2.2 融合蛋白的纯化50-51
• 3.2.3 融合蛋白切除 His 标签51-52
• 3.2.4 Western-blot 验证52-54
• 3.3 Sal 合成酶酶活检测54-57
• 结论57-58
• 参考文献58-71
• 攻读学位期间发表论文与研究成果清单71-72
• 致谢72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 马春,郑长民,王爱民;Parkinson病遗传学研究进展[J];国外医学.遗传学分册;2005年04期

2 陈薛钗;王睿;毛健;丛珍珍;林汉斌;邓玉林;;Salsolinol合成酶的高效液相色谱-电化学活性检测方法研究[J];化学通报;2010年10期

3 王冉;庆宏;邓玉林;;内源性儿茶酚异喹啉神经毒性物质参与帕金森病的研究进展[J];神经解剖学杂志;2008年01期

  本文关键词：Salsolinol合成酶的克隆表达及其生物功能的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：265151