基于iPSCs的疾病细胞模型探究威尔逊氏症成骨过程中β-catenin通路的异常

发布时间：2020-05-10 16:40

【摘要】：背景:威尔逊氏症(WD),ATP7B基因突变引起的罕见的铜代谢障碍的常染色体隐性遗传病。除肝脏,神经症状外,较低的骨密度是WD的另一个最常见的临床特征,但其潜在的机制尚未完全了解。诱导多能干细胞(iPSCs),有着自我更新、生长迅速、可分化为身体各组织器官的潜能且与胚胎干细胞相比没有伦理宗教法律的限制等优点。基于这些优点,掺入基因治疗的iPSCs可以通过体外培养建立一些疾病如威尔逊氏症的细胞模型,进而为相应疾病的治疗提供新的思路与方法。目的:探究威尔逊氏症骨密度低的原因;初步探究威尔逊氏症低成骨活性的机制;筛选小分子促进威尔逊氏症的成骨分化。方法:通过拟胚体(EBs)形成以及添加成骨培养基的方法进行正常和WD iPSCs的成骨诱导并通过荧光实时定量以及茜素红染色从基因型以及表型两方面比较正常对照组和威尔逊氏症组之间成骨表达是否有差异;通过转录组测序技术分析威尔逊氏症和正常iPSCs诱导的成骨细胞的基因表达谱,进而比较正常对照组和威尔逊氏症组之间的差异基因并推测威尔逊氏症组的低成骨活性可能是通过β-catenin途径影响成骨细胞分化的,然后进一步通过免疫蛋白印迹和免疫荧光验证上述推测;最后通过筛选小分子发现SKL2001这个小分子化合物可通过破坏β-catenin/Axin之间的相互作用,稳定细胞内β-catenin蛋白。进而我们通过实时定量以及免疫蛋白印记、免疫荧光验证SKL2001是否可以促进威尔逊氏症组的成骨分化。结果:通过拟胚体(EBs)形成以及添加成骨培养基的方法进行正常和WD iPSCs的成骨诱导并得到在成骨分化的所有阶段中威尔逊氏症成骨细胞中的成骨标志物基因的表达显著低于正常对照组,并且威尔逊氏症成骨细胞中的矿化水平也显著低于正常对照组;通过转录组测序分析得到来自威尔逊氏症的成骨细胞和健康对照之间β-catenin途径存在显着差异,推测威尔逊氏症的低成骨活性可能是通过β-catenin途径影响成骨细胞分化的。然后通过免疫蛋白印记和免疫荧光得到在iPSCs阶段以及在成骨诱导各阶段,威尔逊氏症组的β-catenin的总蛋白的表达略低于正常对照组β-catenin的总蛋白的表达,以及在成骨诱导7天以及21天时,威尔逊氏症组的胞核蛋白中β-catenin的表达也都略低于正常对照组,进而可得到威尔逊氏症的低成骨活性可能与异常的β-catenin途径有关;最后通过查阅文献筛选出了一个小分子药物SKL2001,可通过破坏β-catenin/axin之间的相互作用,稳定细胞内β-catenin蛋白。通过荧光实时定量证明了加入小分子SKL2001处理组成骨细胞的成骨标志性基因的表达较未加入小分子SKL2001处理组成骨细胞的成骨标志性基因的表达有升高,通过免疫蛋白印记以及免疫荧光证明了加入小分子SKL2001处理组成骨细胞β-catenin的表达较未加入小分子SKL2001处理组成骨细胞中的β-catenin的表达向细胞核的转移增加,核蛋白的表达升高,进而激活了下游转录。但却没有剂量依赖性。结论:在本课题中,通过拟胚体(EBs)形成以及添加成骨培养基的方法进行正常和WD iPSCs的成骨诱导并通过与正常对照组比较首次发现了WD-iPSCs衍生的成骨细胞表现出比正常对照组更低的成骨活性。进一步通过基因表达谱的分析,总蛋白和胞核蛋白中β-catenin的检测以及β-catenin的核定位情况,我们鉴定并验证了威尔逊氏症组中低成骨活性可能是由于异常的β-catenin途径所致。最后,通过加入小分子SKL2001处理组与未处理组的比较得到小分子SKL2001可以通过破坏Axin/β-catenin复合物的形成,促进β-catenin的表达量以及向细胞核的转移增加,促进威尔逊氏症组的成骨分化,改善威尔逊氏症骨密度低的现状。因此,我们的上述研究结果表明,威尔逊氏症患者骨密度低和骨质疏松可能是由于异常β-catenin信号通路引起的成骨减少,这些威尔逊氏症患者可能受益于β-catenin靶向策略,以改善骨重建的不平衡。
【图文】：

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图 1 基于 iPSCs 的正常对照和威尔逊氏症的成骨诱导Fig.1 Osteogenesis induction from both normal and WD iPSCs was performed(Scale bar represents 500μm)1.2.2 RT-qPCR 检测成骨标志性基因的表达正常对照组的 iPSCs 和威尔逊氏症的 iPSCs 在经过上述的细胞培养以及成骨诱导后得到的成骨细胞，trizol 试剂分别收集两者定向分化 7 天、14 天以及 21 天的成骨细胞中的 RNA，并且经过 RNA 的提取，cDNA 的逆转录以及 RT-qPCR 的检测，比较两者的成骨标志基因的表达差异，进而初步判断威尔逊氏症的骨密度降低是否与成骨有关。其中control 为正常对照组，WD 为威尔逊氏症组。图 2 为两者定向分化 7 天、14 天以及 21天时成骨细胞成骨标志性基因表达的差异图，如图所示，在诱导 7 天的时候，与正常对照相比，OCN，RUNX2 以及 COL1A1 在 WD 组成骨标志基因的表达约低 2 倍，在诱导14 天的时候，ALP 和 RUNX2 在 WD 组成骨标志基因的表达比正常对照组约低 6 倍，COL1A1 约低 4 倍，虽然 OCN 的差异并没有 ALP，RUNX2，以及 COL1A1 的差异大，

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T-qPCR 检测威尔逊氏症组以及正常对照组成骨细胞的成骨标志性基因的-PCR detect the expression of the osteogenic marker gene in the normal contro(*P < 0.05)染色检测磷酸盐堆积组的iPSCs和威尔逊氏症的iPSCs在经过上述的细胞培养以及成细胞，通过进行茜素红染色，检测其矿化能力。结果如图 3 所示骨诱导 51 天后矿化结节的图，，下图为威尔逊氏症组成骨诱导 51出在同样的阶段时，正常对照组相对于威尔逊氏症组经过茜素红显的红色的矿化结节并且颗粒比较大，密度也比较大，而威尔逊较少近乎没有，并且且颗粒较小，由此可看出在矿化末期，健康尔逊氏症组多且大，即威尔逊氏症组的矿化水平低于正常对照。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.4

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