经典Wnt通路在朊病毒病中抑制及其机制研究

发布时间：2020-05-12 15:13

【摘要】：朊病毒病,又称可传播性海绵状脑病,是一类可引起人和动物中枢神经系统退行性病变的致死性疾病。朊病毒病的致病因子是一种具有致病性的异常朊蛋白,又称为朊病毒。该蛋白由细胞内正常表达的朊蛋白发生蛋白错误折叠转变而来,具有去污剂不溶性、自我复制能力和有限的蛋白酶K抗性。朊病毒可引起人类克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、致死性家族性失眠症(fatal familial insomnia, FFI)、吉斯特曼-斯特劳斯综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome, GSS)以及库鲁病(Kuru)。其中CJD又分为散发型CJD(sporadic CJD, sCJD)、遗传型CJD (genetic CJD, gCJD)、医源型CJD (iatrogenic CJD, iCJD)和变异型CJD (variant CJD, vCJD)四种。朊病毒亦可感染动物,引起麇鹿的慢性消耗性疾病、羊的瘙痒症、牛的海绵状脑病(疯牛病)。朊病毒病的典型神经病理学改变包括脑组织中出现淀粉样斑块沉积、海绵状空泡样变性、神经元丢失及胶质细胞增生。Wnt信号通路是一种广泛存在于真核生物中进化高度保守的信号通路。Wnt信号通路在细胞生长、发育、更新、代谢及迁移等生理过程中起到至关重要的作用。Wnt信号通路可被19种Wnt配体所激活,按细胞中信号传导是否有β连环蛋白(p-catenin)参与,可将其分为经典Wnt信号传导通路(Wnt/β-catenin信号通路)和非经典Wnt信号通路,后者又可分为细胞极性通路(Planar cell polarity pathway, PCP)和Wnt/Ca2+信号通路,其中经典Wnt信号通路研究最为广泛。Wnt信号通路在神经元再生及突触发生等生理过程中起到重要的调节作用。研究表明,Wnt信号通路的失调与许多神经退行性疾病的发病机制相关,如阿尔茨海默症和帕金森病,而在朊病毒病中未见报道。本研究首先以羊瘙痒因子小鼠适应株139A和ME7感染的小鼠脑组织为研究对象,研究朊病毒感染过程中经典Wnt信号通路的变化情况。通过Western blot方法检测到羊瘙痒因子毒株139A和ME7感染终末期的小鼠脑组织中Ser33,Ser37及Thr4’磷酸化β-catenin的表达明显高于正常对照小鼠。同时对经典Wnt信号通路转录调控的下游靶基因cyclin D1的检测发现139A及ME7感染终末期的小鼠脑组织中cyclin D1表达下调。提示在朊病毒感染终末期的小鼠脑组织中经典Wnt信号通路被抑制。由于GSK-3p可使β-catenin磷酸化,但GSK-3β的Ser9磷酸化后可使自身失活丧失,因此我们检测了GSK-3β和Ser9磷酸化GSK-3β的水平变化,结果显示与正常C57BL/6小鼠相比,139A及ME7感染终末期的小鼠脑组织中Ser9磷酸化的GSK-3β与总GSK-3β的比值明显减低,提示朊病毒感染终末期的小鼠脑组织中GSK-3β的活性明显增加。通过对经典Wnt信号通路中的信号分子Wnt-3和正调控分子Dvl-3的蛋白表达水平检测发现,与正常对照相比,139A及ME7感染终末期小鼠脑组织中Wnt-3蛋白的表达下调,而Dvl-3与对照组小鼠脑组织中的表达水平相近。应用Western blot方法检测通路中的负调控分子DKK-1蛋白表达水平发现,139A及ME7毒株感染终末期的C57BL/6小鼠脑组织中DKK-1的蛋白表达明显升高。进一步应用免疫组织化学方法在朊病毒感染的小鼠皮层及小脑区域检测到大量的DKK-1阳性细胞,同时免疫组织荧光结果显示,DKK-1蛋白主要在小鼠神经元中表达。选取感染羊瘙痒因子139A及ME7毒株不同时间点的小鼠脑组织,检测经典Wnt信号通路相关蛋白的动态变化。结果显示,在羊瘙痒因子感染的过程中,随着潜伏期的不断延长,经典Wnt信号通路逐渐被抑制。本研究随后又以稳定感染朊病毒Chandler毒株的小鼠神经瘤细胞系SMB-S15及经硫酸戊聚糖(pentosan sulfate, PS)治疗清除prpSc的细胞对照SMB-PS为研究对象。与对照细胞SMB-PS相比,SMB-S15细胞中,靶基因cyclin D1、c-myc及survivin的mRNA水平明显下降。对细胞模型中经典Wnt信号通路的蛋白变化检测显示,与SMB-PS相比,SMB-S15中Ser33, Ser37, Thr41磷酸化β-catenin的表达明显上调,Ser9磷酸化GSK-3p;表达水平明显下调,cyclin Dl蛋白表达明显下调。我们对正调控分子Wnt-3、Dvl-3及负调控因子DKK-1蛋白进行了Western blot检测,结果显示,与对照细胞SMB-PS相比,SMB-S15细胞中Wnt-3和Dvl-3的表达下调。而SMB-PS细胞中DKK-1的表达明显高于SMB-S15细胞。本研究分别从体内水平和体外水平分别证实了朊病毒感染中经典Wnt/p-catenin信号通路被抑制。
【图文】：

为研究对象，为确保化病毒感染的ＳＭＢ－Ｓ１５细胞中ＰｒｐＳｅ的存在，将提取的细胞逡逑裂解液用终浓度为２５邋＾１３／１１１１＾的蛋白酶１＾邋３７°（：消化１邋ｈ，，然后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑检测，一抗为ＰｒＰ特异性单克隆抗体６Ｄｌｌ。如图８所示，经２５＾ｉｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ逡逑消化后，ＳＭＢ－Ｓ１５细胞中检测到可抵抗蛋白酶Ｋ消化的ＰｒｐＳｅ条带，而ＳＭＢ－ＰＳ逡逑细胞中无ｈｐｓｅ条带。逡逑ＰＳ逦Ｓ１５逡逑ＰＫ逦￣－逦＋■逦￣逦￣逡逑＾３逦—巧邋ｋＤａ逡逑ｍｍ逡逑—巧帕３逡逑Ｂ邋＾逡逑Ｈｕｌｌ逡逑楩哪眼＿巧…。逡逑图８．邋ＳＭＢ－Ｓ１５及ＳＭＢ－ＰＳ细胞中ＰｒｐＳｔ的检n,逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋８．邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋化＃rP校颍穑樱澹rP椋睿rP樱停拢

本文编号：2660410