鞍区朗格汉斯细胞组织细胞增生症和生殖细胞瘤患者的临床特征和脑脊液的特征基因表达的研究

发布时间：2020-05-14 15:05

【摘要】：第一部分鞍区朗格汉斯细胞组织细胞增生症和生殖细胞瘤患者的临床特征背景及目的中枢性尿崩症的病因诊断是内分泌临床诊疗的难点之一,特别是仅表现为垂体柄增粗的患者诊断更加困难,导致垂体柄增粗的病因很多,其中朗格汉斯细胞组织细胞增生症(LCH)、生殖细胞瘤、自身免疫垂体炎等较为常见。LCH和生殖细胞瘤的鉴别诊断困难,缺乏特异性的诊断标记物,目前病情进展的患者通常通过活检取得最终的病理诊断,但有创的病因诊断方法风险大且易造成不可逆的垂体功能损伤,及早、正确和安全的的病因诊断对患者的预后具有重要的临床意义。因此,本课题的研究目的是总结鞍区LCH与鞍区生殖细胞瘤患者的临床病理特点,用以提高临床鉴别诊断水平。方法本研究为回顾性的临床病例研究,收集1993年7月至2017年7月之间在北京协和医院确诊为鞍区LCH或鞍区生殖细胞瘤的患者共181例,其中鞍区LCH患者为89例,鞍区生殖细胞瘤患者为92例,归纳总结其临床特征。连续变量资料中符合正态分布的采用t检验进行分析,符合偏态分布的采用Mann-Whitney U检验;分类变量资料采用卡方检验或Fisher确切分析法进行分析。本研究中采用双侧p值,双侧p值小于0.05认为具有统计学意义。结果共纳入89例鞍区LCH患者以及92例鞍区生殖细胞瘤患者。LCH患者中男性患者52例,女性患者37例(男女比为1.4:1)。生殖细胞瘤患者中男性患者38例,女性患者54例(男女比为0.7:1)。LCH患者年龄中位数为23.0岁(1-53岁),生殖细胞瘤患者年龄中位数为12.5岁(4-35岁),较LCH患者小,有明显统计学差异(p0.001)。在LCH与生殖细胞瘤患者中,中枢性尿崩症(central diabetes insipidus,CDI)均为最常见的首发症状,发生率分别是70.8%、77.2%。89例LCH患者均为活检确诊,其中鞍区活检14例;92例生殖细胞瘤患者中,83例为颅内活检确诊,9例为临床诊断。不同病因对患者垂体前叶功能的影响不同,鞍区LCH最常受累的是HPG轴(48.3%),其次是 HPT 轴(39.3%)、GH-IGF-1 轴(39.3%)以及 HPA 轴(28.1%);鞍区生殖细胞瘤最常受累的是HPT轴(67.4%),其次是HPA轴(65.2%)、HPG轴(51.1%)和 GH-IGF-1 轴(47.8%)。血清学和脑脊液生化检测方面,LCH患者脑脊液检验的总细胞数(LCH,中位 7.0×106/L(0-7200.0×106/L);生殖细胞瘤,中位 28.0×106/L(0-7815.0×106/L);p=0.001)、白细胞数(LCH,中位1.5×106/L(0-8.O×106/L);生殖细胞瘤,中位4.0×106/L(0-62.0×106/L);p=0.002)、单核细胞数(LCH,中位 0.5×106/L(0-5.O×106/L);生殖细胞瘤,中位 6.0×106/L(0-52.0×106/L);p0.001)、葡萄糖(LCH,中位 3.3mmol/L(2.8-6.9mmol/L);生殖细胞瘤,中位 3.2mmol/L(2.4-4.6mmol/L);p=0.010)以及 β-hCG(LCH,中位 3.5 mIU/ml(0-6.6 mIU/ml);生殖细胞瘤,中位5.4 mIU/ml(0.2-36.3 mIU/ml);p=0.032)在两组中有明显统计学差异。血清β-hCG在LCH患者中为中位0.1mIU/ml(0-6.0mIU/ml),生殖细胞瘤患者中为中位1.3 mIU/ml(0-40.4mIU/ml),生殖细胞瘤患者脑脊液β-hCG水平显著高于LCH(p0.001)。根据头颅核磁共振影像分析,LCH与生殖细胞瘤患者单纯累及垂体柄的最多,各有28例(47.5%)和40例(43.5%);累及垂体柄和垂体的分别有1例(1.7%)和16例(17.4%),累及垂体柄和下丘脑的分别有6例(10.2%)和9例(9.8%),累及垂体柄、垂体和下丘脑的分别有6例(10.2%)和17例(18.5%),累及头颅其他部位的分别有18例(30.5%)和10例(10.9%)。结论本研究表明在本中心患者中,LCH患者的男性比例及发病年龄显著高于生殖细胞瘤患者,脑脊液总细胞数、白细胞数、单核细胞数、β-hCG及血清β-hCG显著低于鞍区生殖细胞瘤患者,脑脊液葡萄糖显著高于生殖细胞瘤患者,最常受累的是HPG轴,其次是HPT轴、GH-IGF-1轴以及HPA轴,而鞍区生殖细胞瘤最常受累的是HPT轴,其次是HPA轴、HPG轴和GH-IGF-1轴。但病因学诊断仍是此类患者的诊断难点,缺乏特异性的诊断标志物。第二部分鞍区朗格汉斯细胞组织细胞增生症和鞍区生殖细胞瘤患者脑脊液细胞的特征基因表达的分析研究背景鞍区LCH和鞍区生殖细胞瘤的鉴别诊断主要依靠病理免疫组化,LCH的特异性标记物包括CDla、S-100、CD207蛋白,生殖细胞瘤的特异标记物包括PLAP、OCT3/4、SALL4蛋白等。然而鞍区活检风险大、有时活检组织太少而检出率不高,且患者经济负担与心理负担较重。既往研究表明,鞍区LCH和鞍区生殖细胞瘤的脑脊液中均可能找到脱落的肿瘤细胞,然而常规细胞学检查检出率很低,应用受限。目的本研究尝试利用“液态活检”的思路,采用数字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)的方法,建立脑脊液中脱落细胞的特异基因的表达检测平台,对LCH和生殖细胞瘤相关特异基因的表达水平进行检测,探索其鉴别两种疾病的可行性。方法收集2018年2月至2018年5月北京协和医院内分泌科及神经外科怀疑鞍区LCH或鞍区生殖细胞瘤患者的脑脊液和临床资料,包括活检免疫组化结果。共9例,男女比例为1:8。另收集1例脑积水患者的脑脊液作为阴性对照。分别用两步法ddPCR和一步法ddPCR对脑脊液细胞进行特异标记基因的mRNA水平进行检测。具体操作如下,留取lml脑脊液,离心,取细胞沉淀进行RNA提取。两步法ddPCR检测,首先进行总RNA逆转录,然后用cDNA配制反应体系,进行PCR扩增和检测;一步法ddPCR检测,直接用总RNA配制反应体系,反转录、PCR扩增和检测一起进行。检测的基因包括LCH的特异性标记物基因CDla、S-100、CD207和生殖细胞瘤的特异标记基因PLAP、OCT3/4、SALL4。检测结果采用QuantaSoft进行分析数据。根据无模版对照的微滴信号划定阈值线,超过阈值线的视为阳性微滴。根据体系中核酸拷贝数计算脑脊液中的特异标记基因的核酸浓度。结果采用数字PCR(ddPCR)方法,初步建立鉴别诊断鞍区LCH和鞍区生殖细胞瘤患者脑脊液细胞中的特征性基因表达分析的方法。首先,采用两步法扩增P#l-6患者的内参基因β-actin。结果发现6个样本的内参基因均能扩增,而且表达量高,为5.96×105-108/mlCSF,提示两步法可以用于内参基因的ddPCR扩增。其次,采用两步法扩增LCH的特异性标记物基因CD1a、S-100、CD207和生殖细胞瘤的特异标记基因PLAP、OCT3/4、SALL4,结果发现,6个特征性表达的基因均能良好扩增,提示两种疾病的特征性表达基因也能采用两步法进行ddPCR的扩增。再次,采用一步法扩增P#9患者的特征性表达的基因,结果发现,特征性表达基因也能很好地扩增,而且扩增的拷贝数远大于两步法,阳性微滴较密集,与阴性微滴分界清晰。减少上样总RNA量,特征性表达的基因也能良好扩增,判读结果具有一致性。选择3ul总RNA上样量是最合适的。最后,才用一步法,对作为阴性对照的脑积水患者进行了上述两次ddPCR扩增,均无阳性微滴,说明该方法的特异性较好。采用上述建立的ddPCR方法(一步法和两步法),扩增鞍区LCH和鞍区生殖细胞瘤患者脑脊液细胞中的特征性表达基因。P#1-3患者采用两步法对脑脊液细胞进行上述6个基因mRNA水平的检测,结果发现,P#1患者的S-100、CD207基因扩增判读为阳性,拷贝数分别为23.2个/ml CSF、128个/ml CSF;P#2患者的S-100、CD207基因扩增判读为阳性,拷贝数分别为644个/mlCSF、140个/ml CSF;其余基因扩增判读为阴性,提示这两名患者可能为LCH。临床尚未给出明确诊断。P#3患者的S-100、CD207阳性,拷贝数分别为57.4/ml CSF、84/ml CSF,提示可能为LCH,临床上也疑诊LCH。P#4-6患者采用两步法进行脑脊液细胞CD1a、S-100、OCT3/4的mRNA水平的检测。结果发现P#4-6患者的CD1a、S-100、OCT3/4均为阴性,其中P#4临床活检诊断为节细胞胶质瘤,P#5、6临床诊断不明。P#7-9患者采用一步法进行检测,其中P#7患者无阳性微滴,提示既不是LCH,也不是生殖细胞瘤,临床活检病理诊断为颗粒细胞瘤;P#8患者的CD1a、CD207基因扩增判读为阳性,拷贝数分别为1080个/ml CSF、468个/ml CSF,提示可能为LCH,临床活检病理诊断为LCH,免疫组化示S-100阳性,SALL4阴性;P#9进行一步法三次重复检测,均为CD1a、S-100、CD207、PLAP、OCT3/4阳性,临床病理诊断为生殖细胞瘤,免疫组化示S-100、OCT3/4和SALL4阳性。结论初步尝试建立了采用ddPCR方法,鉴别鞍区LCH和鞍区生殖细胞瘤患者脑脊液细胞中的特征性基因表达分析的方法。一步法和两步法ddPCR均能扩增两种疾病患者脑脊液细胞中的特征性表达基因,但一步法的扩增效率高,重复性好。临床可行性尚需扩大样本量进行进一步的研究。P#1-3、P#8患者的实验结果显示为LCH,其中P#3患者临床疑诊LCH、P#8患者临床活检确诊LCH;P#4-7患者目前实验结果不支持LCH或生殖细胞瘤,其中P#4患者活检为节细胞胶质瘤、P#7患者为颗粒细胞瘤。P#9患者生殖细胞瘤和LCH相关标记物均阳性,临床活检诊断为生殖细胞瘤。
【图文】：

垂体前叶,患者,垂体,功能

（６７．４％），其次为邋ＨＰＡ邋轴邋６０邋例（６５．２％）、ＨＰＧ邋轴邋４７邋例（５１．１％）、ＧＨ－ＩＧＦ－１逡逑轴４４例（４７．８％），ＬＣＨ患者有９例（１０．１％）表现为全垂体前叶功能受损，生逡逑殖细胞瘤患者有１８例（１９．６％）（表３，图１）。逡逑１７逡逑

信号值,两步法,患者,微滴

逦北京协和医学院博士研宄生论文界清晰（图３－２、图３－４），，ｐ－ａｃｔｉｎ拷贝数足够多（表３－２、３－３）。逡逑１）逦Ｐ＃ｌ、Ｐ＃２、Ｐ＃３患者两步法ｄｄＰＣＲ扩增ｐ－ａｃｔｉｎ的微滴生成、扩增信号值基因拷贝数见图３－１、图３－２和表３－２。逡逑２００００邋逦邋１９１０７逦逦逡逑１８００１逦…
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

【参考文献】