叶酸缺乏通过线粒体STAT3介导缺血再灌后神经细胞损伤的机制研究

发布时间：2020-05-16 09:30

【摘要】：目的通过线栓法制备SD大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血再灌注模型,观察叶酸缺乏(folic acid deficiency,FD)对脑缺血再灌注后大脑线粒体损伤的影响,通过叶酸缺乏和JAK2/STAT3抑制剂AG490联合干预,探讨线粒体内信号转导及转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在叶酸缺乏引起的脑缺血再灌注损伤中的作用。体外培养N2a细胞,建立氧糖剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,检测叶酸缺乏对N2a细胞活力的影响,不同通路的抑制剂分别与叶酸缺乏联合干预,探讨叶酸缺乏对N2a细胞线粒体内STAT3不同活化位点的具体调控机制,为脑梗塞疾病的预防及治疗提供新的思路及实验依据。方法1.125只体重为160-180 g的雄性SD大鼠,采用随机数字表法分为5组,分别为假手术组(SHAM)、大脑中动脉缺血再灌注模型组(MCAO)、模型+叶酸缺乏组(MCAO+FD)、模型+叶酸缺乏+AG490组(MCAO+FD+AG490)及模型+AG490组(MCAO+AG490),每组25只。SHAM、MCAO组、MCAO+AG490组大鼠用正常对照饲料饲养,MCAO+FD和MCAO+FD+AG490组大鼠用叶酸缺乏饲料饲养,MCAO模型前,叶酸缺乏预干预25 d。MCAO+FD+AG490和MCAO+AG490组在手术前1 h以4 m L/kg·d剂量进行腹腔注射浓度为0.75 mg/m L的AG490溶液。造模后24 h通过TTC染色法测定大鼠脑梗死体积;FJB染色法检测大鼠脑组织皮质区神经细胞损伤情况;透射电镜观察大脑线粒体损伤情况;免疫荧光双标法检测脑组织线粒体内p Y-STAT3和p S-STAT3表达情况;蛋白免疫印迹检测脑组织中线粒体中p Y-STAT3、p S-STAT3、JAK2、p-JAK2蛋白表达。2.体外培养N2a细胞,建立细胞OGD/R模型,分别用AG490、LY294002、U0126抑制剂与叶酸缺乏联合干预,CCK-8检测细胞活力,Western blot检测线粒体中p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT、p-JNK、JNK的表达情况。结果1.与MCAO组比较,叶酸缺乏干预组:TTC染色法结果显示脑梗死体积增大;FJB染色法结果显示神经细胞损伤明显加重;透射电镜观察及线粒体损伤评分结果显示,线粒体严重损伤;免疫荧光检测结果显示,大脑海马皮质线粒体标记物COX IV与p Y-STAT3、COX IV与p S-STAT3双阳性细胞数均进一步增加;Western blot检测结果显示,脑组织线粒体中p Y-STAT3、p S-STAT3、p-JAK2蛋白表达均升高,以上各个指标两组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。与MCAO+FD组比较,MCAO+FD+AG490组:神经细胞损伤减轻;脑组织线粒体损伤减轻;免疫荧光检测结果显示,大脑皮质区线粒体COX IV与p Y-STAT3双阳性细胞数较少;Western blot检测结果显示,脑组织中线粒体中p Y-STAT3、p-JAK2表达降低,以上各个指标的两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。p S-STAT3蛋白表达量无明显改变(P0.05)。2.体外培养N2a细胞,建立细胞OGD/R模型,Western blot检测结果显示,细胞复氧30 min时,N2a细胞线粒体中p Y-STAT3蛋白表达量达到高峰;细胞复氧45 min时,p S-STAT3蛋白表达量达到高峰。分别用AG490、LY294002、U0126与叶酸缺乏联合干预细胞,Western blot检测结果显示,与对照组比,OGD/R组细胞线粒体中的p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT表达量增加,差异具有统计学意义(P0.05),而p-JNK蛋白无明显变化(P0.05)。与OGD/R组比较,OGD/R+FD组细胞线粒体中的p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT表达量进一步增加,差异具有统计学意义(P0.05),p-JNK蛋白无明显变化(P0.05)。与OGD/R+FD相比,OGD/R+FD+AG490组p Y-STAT3蛋白表达量下降,差异具有统计学意义(P0.05),p S-STAT3蛋白表达量无明显变化(P0.05);OGD/R+FD+LY294002组、OGD/R+FD+U0126组p S-STAT3蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义(P0.05),p Y-STAT3蛋白表达量无明显变化(P0.05)。CCK-8结果显示:与对照组相比,OGD/R组细胞活力下降,差异具有统计学意义(P0.05)。与OGD/R组相比,OGD/R+FD组细胞活力进一步下降,差异具有统计学意义(P0.05);与OGD/R+FD组相比,OGD/R+FD+AG490组、OGD/R+FD+LY294002组、OGD/R+FD+U0126组细胞活力均上升,差异具有统计学意义(P0.05)。结论建立大鼠脑缺血再灌注模型,发现叶酸缺乏增加了脑缺血再灌注后脑梗死面积、神经细胞凋亡及线粒体损伤,上调脑组织线粒体中p Y-STAT3、p S-STAT3 p-JAK2的表达,给予JAK2/STAT3通路抑制剂AG490后,叶酸缺乏引起的上述效应除p S-STAT3的表达量无明显改变外,其余均在一定程度上被抑制。说明叶酸缺乏可能部分通过JAK2/STAT3通路上调线粒体中p Y-STAT3加剧大脑缺血后脑组织及线粒体损伤,叶酸缺乏对p S-STAT3的表达调控可能与JAK2/STAT3通路的激活无关。体外实验成功建立N2a细胞OGD/R模型。叶酸缺乏干预后,上调细胞线粒体中p Y-STAT3、p S-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT,细胞活力显著下降。给予AG490抑制剂后,细胞活力升高,p Y-STAT3的表达量下降,p S-STAT3的表达量无明显改变,与体内结果一致。给予LY294002或U0126抑制剂后,细胞活力均升高,p S-STAT3表达量下降,p-ERK1/2或p-AKT的表达量下调,p Y-STAT3的表达量无明显改变,提示叶酸缺乏对线粒体p S-STAT3的调控可能与PI3K-AKT、MAPK/ERK1/2两条通路有关,且对p Y-STAT3的调控独立于这两条通路。p-JNK蛋白无明显改变,提示JNK通路可能未参与到STAT3的活化过程。综上两部分结果,我们得出结论:叶酸缺乏可以通过JAK2/STAT3通路上调线粒体中p Y-STAT3,通过PI3K/AKT、MAPK/ERK1/2通路上调线粒体中p S-STAT3,以上通路协同作用下加剧了脑缺血后脑组织神经细胞及线粒体损伤。
【图文】：

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1 叶酸缺乏对脑梗死大鼠梗死灶体积百分比的影响。A：各组大鼠脑组织 TTC 染色图。组大鼠梗死灶体积统计分析。*：与 SHAM 组比较，#：与 MCAO 组比较，P<0.05.2.3 叶酸缺乏对脑缺血再灌注后大鼠脑组织神经细胞损伤的影响大鼠脑组织切片经 FJB 染色，倒置荧光显微镜下观察大脑皮质区缺血半附近阳性细胞数，结果显示：SHAM 组大脑皮质区阳性细胞数很少，MCA、MCAO+FD 组均可见数量不等的阳性细胞，见图 2A。与 SHAM 组比较CAO 组阳性细胞数显著增多，差异具有统计学意义（P<0.05）。与 MCAO 比，MCAO+FD 组阳性细胞数进一步增多，差异具有统计学意义（P<0.05）图 2B。

叶酸缺乏,神经细胞损伤,脑梗死

15图 2 叶酸缺乏对脑梗死大鼠脑组织神经细胞损伤的影响。A：各组大鼠 FJB 染色结果（FJB绿色、DAPI 蓝色、MERGE 为二者合图）；B： FJB/DAPI 双标阳性细胞统计分析，*：与SHAM 组比较，#：与 MCAO 组比较，P<0.05，标尺=50 μm，放大倍数=10×201.2.4 叶酸缺乏对缺血再灌大鼠脑组织线粒体超微结构的影响为了检测叶酸缺乏对神经系统线粒体的影响，在电镜下对叶酸缺乏干预后脑缺血再灌注后大鼠皮质区线粒体形态变化进行观察。结果如图3A所示，SHAM组皮质区的神经元细胞，，细胞形态正常，核膜完整，各个细胞器未见肿胀或消失。线粒体形态正常，双层膜完整，嵴排列规整。与 SHAM 组相比，脑缺血再灌 24 h 后，MCAO 组神经元细胞部分线粒体发生肿胀，双层膜不完整，嵴排列紊乱甚至断裂，个别线粒体出现空泡化，少数线粒体保持完整结构，其他细胞器部分发生肿胀。与 MCAO 组相比，MCAO+FD 组神经元细胞损伤最为明显，
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3

【参考文献】