NR2B-Tyr磷酸化调控突触可塑性参与大鼠慢性偏头痛的中枢致敏

发布时间：2020-05-16 17:52

【摘要】：背景:慢性偏头痛(chronic migraine,CM)的病理生理机制目前尚不清楚,大量的研究认为中枢致敏和神经元活性的持续增高与之有关。我们前期的研究发现三叉神经脊束核尾核(Trigeminal nucleus caudalis,TNC)N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)NR2B亚基的酪氨酸磷酸化有助于脊髓中枢致敏和持续性疼痛。中枢致敏通常被认为与突触传递效率的增加有关,但NR2B-Tyr磷酸化是否通过调节突触可塑性的变化参与CM的中枢致敏机制目前尚不清楚。在本研究中,我们的目的是探究NR2B-Tyr磷酸化是否通过调控突触可塑性参与慢性偏头痛模型大鼠的中枢致敏机制。材料与方法:1.实验分组:成年雄性SD大鼠随机分为7组。A、sham组,硬脑膜外连续滴注PBS,2μl,共7天。B、CM组,硬脑膜外连续滴注IS,2μl,共7天。C、CM+DMSO组,硬脑膜外连续滴注7天2μl的IS后,侧脑室给予DMSO,5μl。D、CM+PP2高剂量组,硬脑膜外连续滴注7天2μl的IS后,侧脑室给与5μl高浓度的PP2。E、CM+PP2低剂量组,硬脑膜外连续滴注7天2 μl的IS后,侧脑室给与5 μl低浓度的PP2。F、CM+genistein高剂量组,硬脑膜外连续滴注7天2 μl的IS后,侧脑室给与5 μl高浓度的genistein。G、CM+genistein低剂量组,硬脑膜外连续滴注7天2 μl的IS后,侧脑室给与5 μl低浓度的genistein。2.硬脑膜外连续给予IS或PBS,共7天,反复激活硬脑膜传入神经,模拟偏头痛的发作,建立慢性偏头痛大鼠模型。3.给予NR2B-Tyr磷酸化抑制剂PP2和genistein,然后使用Von Frey test法测定大鼠眶周及足底的机械痛阈值,Western blot和免疫荧光技术检测NR2B、NR2B-pTyr、CGRP以及相关突触可塑性蛋白指标如PSD95、Syp、Syt-1表达水平变化,定位情况和荧光强度变化,透射电镜观察TNC部位Gray I突触的超微结构,Golgi-cox染色法对神经纤维染色,观察TNC部位树突棘数量的变化。结果:1.CM组相较于Sham组,大鼠眶周及足底的机械痛阈值均显著降低,给予以高剂量NR2B-Tyr磷酸化抑制剂PP2和genistein后大鼠眶周及足底的痛觉过敏明显缓解。2.CM组NR2B-pTyr水平与sham组相比显著增高,CGRP及突触可塑性相关蛋白PSD95、Syp、Syt-1的表达水平和荧光强度均显著增高,但NR2B的总蛋白表达水平在两组大鼠中并没有明显变化。透射电镜结果显示与sham大鼠相比,CM大鼠TNC神经元的突触超微结构表现出突触后致密物增厚,突触间隙增宽,突触界面曲率明显增大,突触活性区长度明显增长的现象。Golgi-cox结果显示CM大鼠TNC部位树突棘密度明显增加。3.给予高剂量NR2B-Tyr磷酸化抑制剂PP2和genistein后NR2B-pTyr水平在大鼠TNC部位明显降低,CGRP及突触可塑性相关蛋白PSD95、Syp、Syt-1蛋白表达水平和荧光强度均明显降低。透射电镜结果显示PP2和genistein的施用逆转了 TNC部位突触后致密物的增厚,突触间隙的增宽、突触界面曲率和突触活性区长度的增加。Golgi-cox结果显示与CM+DMSO组大鼠相比,CM大鼠TNC部位树突棘密度明显减少。结论:1.硬脑膜外反复滴注1S后,大鼠眶周及足底的机械痛阈值均显著降低,表明CM模型成功建立;2.NR2B-Tyr磷酸化水平增高促进CM的发生;3.NR2B-Tyr磷酸化调控突触结构可塑性相关蛋白PSD95、Syp和Syt-1的表达,同时改变突触的超微结构,提示NR2B-Tyr磷酸化调控突触可塑性参与CM的病理生理过程。
【图文】：

足底痛,大鼠,阈值,对照组

图１对照组（ＰＢＳ）与ＣＭ组（ＩＳ）大鼠眶周及足底痛阈值逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ邋ａｌｌｏｄｙｎｉａ邋ｉｎ邋ｒａｔｓ逡逑（Ａ）邋Ｔｈｅ邋ｐａｉｎ邋ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｅｒｉｏｒｂｉｔａｌ邋ｒｅｇｉｏｎ邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｄｅｃｒｅａｓｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｒｅｅ邋ｄａｙｓ逡逑ＩＳ邋ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｏｓｅ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｒｅｅ邋ｄａｙｓ邋ｏｆ邋ＰＢＳ邋ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ．邋（Ｂ）邋Ａ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ逡逑ｒｅａｓｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｈｉｎｄｐａｗ邋ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ邋ｗａｓ邋ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｒｅｅ邋ｄａｙｓ邋ｏｆ邋ＩＳ邋ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ逡逑ｓｅ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｒｅｅ邋ｄａｙｓ邋ｏｆ邋ＰＢＳ邋ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ邋（＊ｐ邋＜邋０．０１）．逡逑硬脑膜外反复滴注ＩＳ后，大鼠ＴＮＣ部位ＮＲ２Ｂ－ｉｙｒ磷酸化水平明显增加逡逑为了研究ＮＲ２Ｂ及其磷酸化形式在ＣＭ大鼠ＴＮＣ部位的变化，我们观察了逡逑２Ｂ及其相关磷酸化位点在ＣＭ大鼠中的表达水平（图２）。我们发现总ＮＲ２Ｂ逡逑蛋白水平在两组大鼠ＴＮＣ部位表达无明显差异，而ＣＭ组ＮＲ２Ｂ受体亚基在酪逡逑１４７２和１２５２位点磷酸化水平较ｓｈａｍ组显著升高（／？＜０．０５）。这说明ＮＲ２Ｂ逡逑氨酸磷酸化是其主要的激活方式，也与我们的设想一致。逡逑５逦ＣＭ逡逑ＰＮＲ２Ｂ－Ｙ１４７２逦＿邋ｉｉ邋１＾１＾１邋册ｋＤａ逡逑

大鼠,位点,部位,对照组

２．２硬脑膜外反复滴注ＩＳ后，大鼠ＴＮＣ部位ＮＲ２Ｂ－ｉｙｒ磷酸化水平明显增加逡逑为了研究ＮＲ２Ｂ及其磷酸化形式在ＣＭ大鼠ＴＮＣ部位的变化，我们观察了逡逑ＮＲ２Ｂ及其相关磷酸化位点在ＣＭ大鼠中的表达水平（图２）。我们发现总ＮＲ２Ｂ逡逑的蛋白水平在两组大鼠ＴＮＣ部位表达无明显差异，，而ＣＭ组ＮＲ２Ｂ受体亚基在酪逡逑氨酸１４７２和１２５２位点磷酸化水平较ｓｈａｍ组显著升高（／？＜０．０５）。这说明ＮＲ２Ｂ逡逑的酪氨酸磷酸化是其主要的激活方式，也与我们的设想一致。逡逑５逦ＣＭ逡逑ＰＮＲ２Ｂ－Ｙ１４７２逦＿邋ｉｉ邋１＾１＾丨邋１邋册ｋＤａ逡逑ＰＮＲ２Ｂ－Ｙ１２５２邋？邋＾逦＾逦１６６ｋＤａ逡逑ｔＮＲ２Ｂ邋｜逦１Ｓ６ｋＤａ逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ邋Ｉ逡逑２．０－ｊ逦＾邋Ｓ逡逑＊逦■邋ＣＭ逡逑丨：ｎ＿逡逑ｇ：ｉｎｉ逦ｎｉ逦ｉｎ逡逑＾逦Ｗ逦，逡逑图２对照组（ＰＢＳ）与ＣＭ组（ＩＳ邋）大鼠ＴＮＣ部位ＮＲ２Ｂ蛋白表达水平及其Ｙ１４７２与Ｙ１２５２逡逑位点路l#酸淲酸化水平逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＮＲ２Ｂ邋ａｎｄ邋ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ邋ＮＲ２Ｂ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ＴＮＣ邋ｏｆ邋ＣＭ邋ｒａｔｓ逡逑（Ａ）邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｓ邋ｏｆ邋ＮＲ２Ｂ－Ｙ１４７２
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R747.2

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