Ndfip1对鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞的神经保护作用机制研究

发布时间：2020-05-20 23:26

【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,其病理特征为黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元的渐进性缺失及路易小体的形成,由此导致纹状体(striatum,Str)DA含量的降低。尽管PD的病因和发病机制尚未完全阐明,研究认为包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、线粒体功能缺失和泛素蛋白酶体系统功能障碍等多种因素均参与了PD的发病。α-突触核蛋白是PD特征性病理包涵体-路易小体的主要成分。越来越多的证据表明α-突触核蛋白的异常表达和聚集在PD发病中发挥着至关重要的作用。因此,清除异常聚集的α-突触核蛋白对于PD的治疗具有重要意义。Ndfip1是一种跨膜蛋白,含有221个氨基酸残基,结构上含有两个PPx Y基序,能够与Nedd4泛素连接酶的WW结构域结合,以介导泛素依赖性蛋白质降解。Ndfip1作为某些蛋白质泛素化过程的早期传感器蛋白,通过与E3连接酶共同作用,清除神经细胞中有害的错误折叠蛋白质,促进神经细胞的存活,从而起到抗凋亡作用。研究表明Ndfip1在脑缺血和创伤性脑损伤后存活神经元中均有高水平的表达,同时伴随其结合蛋白Nedd4表达水平增加,推测这两种蛋白质的高表达及相互作用可能有助于促进损伤神经细胞的存活。但是Ndfip1在PD中的神经保护作用及机制尚未完全阐明。因此,本实验在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞上应用荧光实时定量PCR、免疫印迹、腺病毒技术及免疫荧光等方法研究了Ndfip1对线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞的神经保护作用及可能的机制,并进一步探讨了Ndfip1对鱼藤酮诱导的PD细胞模型中α-突触核蛋白的蛋白水平的影响。实验结果为揭示PD的发病机制和研制新一代治疗药物提供新的理论依据和治疗靶点。结果:1、300 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞3 hrs、6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后检测α-突触核蛋白的m RNA水平变化。结果表明,鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞12 hrs、24 hrs后α-突触核蛋白的m RNA水平与对照组相比分别增强164.3%(P0.01),219.5%(P0.001),差异有显著性。2、300 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞3 hrs、6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后检测α-突触核蛋白的蛋白水平变化。结果表明,α-突触核蛋白的表达水平于鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞6 hrs后开始增加;300 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后α-突触核蛋白的表达水平与对照组相比,分别上调106.6%(P0.05),188.9%(P0.01),213.6%(P0.01),311.6%(P0.001),差异有显著性。3、300 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞3 hrs、6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后检测Ndfip1的m RNA水平变化。结果表明,Ndfip1的m RNA水平于鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞6 hrs后开始增加;300 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞6 hrs、9 hrs后,Ndfip1的m RNA水平与对照组相比,分别上调83.7%(P0.05),69.6%(P0.05),差异有显著性。4、300 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞3 hrs、6 hrs、9 hrs、12 hrs、24 hrs后检测Ndfip1的蛋白水平变化。结果表明Ndfip1蛋白的表达水平于鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞3 hrs后开始增加;鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞3 hrs,6 hrs,9 hrs后,Ndfip1的蛋白水平与对照组相比,分别上调34.2%(P0.01),62.9%(P0.001),27.4%(P0.01),差异有显著性。鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 hrs后Ndfip1蛋白的表达水平与对照组相比降低22.5%(P0.05),差异有显著性。5、重组腺病毒感染SH-SY5Y细胞24 hrs后与鱼藤酮共孵育24 hrs,鱼藤酮处理组及Ad.GFP/鱼藤酮组细胞中的TH蛋白的表达水平与对照组相比分别下调37.5%(P0.001)和44.2%(P0.001),差异有显著性;Ad.Ndfip1/鱼藤酮组细胞中的TH蛋白的表达水平与鱼藤酮组相比上调37.7%(P0.01),差异有显著性。6、重组腺病毒感染SH-SY5Y细胞24 hrs后与鱼藤酮共孵育24 hrs,鱼藤酮处理组及Ad.GFP/鱼藤酮组细胞中的caspase-3蛋白的表达水平与对照组相比分别上调60.3%(P0.05)和75.4%(P0.01),差异有显著性;Ad.Ndfip1/鱼藤酮组细胞中的Caspase-3蛋白的表达水平与鱼藤酮组相比下调29.0%(P0.05),差异有显著性。7、重组腺病毒感染SH-SY5Y细胞24 hrs后与鱼藤酮共孵育24 hrs,鱼藤酮组及Ad.GFP/鱼藤酮组细胞中的Ndfip1蛋白的表达水平与对照组相比分别下调35.5%(P0.05),49.5%(P0.01),差异有显著性;Ad.Ndfip1/鱼藤酮组细胞中的Ndfip1蛋白的表达水平与鱼藤酮组和Ad.GFP/鱼藤酮组分别相比上调130.2%(P0.001)和194.5%(P0.001),差异有显著性。8、重组腺病毒感染SH-SY5Y细胞24 hrs后与鱼藤酮共孵育24 hrs,鱼藤酮组及Ad.GFP/鱼藤酮组细胞中的α-突触核蛋白的表达水平与对照组相比分别上调86.8%(P0.01)和88.7%(P0.01),差异有显著性;Ad.Ndfip1/鱼藤酮组细胞中的Ndfip1蛋白的表达水平与鱼藤酮组和Ad.GFP/鱼藤酮组相比分别下调31.9%(P0.05)和37.4%(P0.05),差异有显著性;免疫荧光结果表明,鱼藤酮处理细胞后细胞α-突触核蛋白的表达明显增加,Ad.Ndfip1感染的SH-SY5Y细胞中的α-突触核蛋白的蛋白水平明显降低。结论:鱼藤酮诱导的PD细胞模型中Ndfip1的表达减少伴随着α-突触核蛋白的表达增加,且高表达Ndfip1能够抑制由鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞的形态学变化,caspase-3蛋白的表达增加,TH蛋白表达减少及α-突触核蛋白表达的上调。提示Ndfip1对鱼藤酮诱导的PD模型具有保护作用。本实验所研究的Ndfip1对鱼藤酮诱导的PD细胞模型的保护作用及其可能机制的探讨,为进一步深入探讨缓解PD发病过程中α-突触核蛋白异常聚集所致的神经毒性及干预措施,提供了新的实验依据。
【图文】：

结果结 果1. 鱼藤酮上调 SH-SY5Y 细胞中α-突触核蛋白的表达我们使用 300 nmol/L 鱼藤酮对 SH-SY5Y 细胞进行处理后，应用实时定量 PCR 和免疫印迹的方法分别检测了α-突触核蛋白的 mRNA 及蛋白水平随时间的变化情况。结果显示，与对照组相比，在鱼藤酮处理 SH-SY5Y 细胞 12 hrs 和 24 hrs 后可显著增加α-突触核蛋白的 mRNA 表达水平（图 1A）。免疫印迹法检测结果表明，，与对照组相比，鱼藤酮处理 SH-SY5Y 细胞 6 hrs 后，α-突触核蛋白的蛋白表达开始上调，鱼藤酮处理SH-SY5Y 细胞 9 hrs，12 hrs 和 24 hrs 后，α-突触核蛋白的蛋白表达水平进一步增加（图1B），差异均具有统计学意义。

青岛大学硕士学位论文2. 鱼藤酮处理的 SH-SY5Y 细胞 Ndfip1 的表达变化为了研究鱼藤酮处理是否会影响 Ndfip1 的表达，我们检测了 Ndfip1 在 mRNA 和蛋白质水平上随时间的表化情况。结果显示，鱼藤酮处理后，在 6 hrs 和 9 hrs 时 Ndfip1的 mRNA 水平表达增加（图 2A），与对照组相比，差异有统计学意义。同时，我们还通过免疫印迹法检测了鱼藤酮处理的 SH-SY5Y 细胞中 Ndfip1 的蛋白水平。结果显示，鱼藤酮处理 SH-SY5Y 细胞 3 hrs，6 hrs，9 hrs 后，Ndfip1 的蛋白水平与对照相比明显增加；而在鱼藤酮处理 SH-SY5Y 细胞 24 hrs 后，Ndfip1 的蛋白表达与对照相比降低，差异具有统计学意义（图 2B）。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5

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