miR-218-5p靶向调控HMGB1对胶质瘤的抑制作用及机制研究

发布时间：2020-05-21 02:02

【摘要】：背景:神经胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,约占原发性脑和中枢神经系统恶性肿瘤的80%。具有高侵袭性,易复发,高死亡率等特性。虽然近年来显微外科技术、神经影像技术以及放化疗治疗方案等方面均取得了长足的进步,但对于胶质瘤患者,尤其是高级别的胶质瘤患者,预后仍然不佳。因此,需要进一步深入了解胶质瘤发生发展机制,探索新的胶质瘤分子及靶向治疗方法。随着近年来对miRNA研究的深入,其在包括胶质瘤在内的多种肿瘤发生发展中的作用日益凸显。miR-218-5p在多种癌症中表达下调,并与临床分期、预后和转移相关。miR-218-5p在胶质瘤发生发展中的作用及其分子机制仍需进一步研究。目的:1.通过分析胶质瘤中差异表达miRNA选取miR-218-5p为研究对象,分析miR-218-5p在胶质瘤组织中的表达及与胶质瘤患者预后之间的关系。2.通过以U251细胞为研究对象研究miR-218-5p对胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。3.预测并验证miR-218-5p的靶基因为HMGB1,研究miR-218-5p抑制胶质瘤生长的分子机制。通过动物实验验证miR-218-5p在体内对胶质瘤生长的影响及miR-218-5p与HMGB1的靶向关系。方法:1.利用生物信息学方法筛选胶质瘤中差异表达miRNA,通过实时荧光定量PCR法检测miR-218-5p在胶质瘤中的表达。分析胶质瘤中miR-218-5p表达水平与临床预后之间的关系。2.以U251为研究对象,通过转染miR-218-5p mimic过表达miR-218-5p,利用CCK-8实验、细胞划痕愈合实验、Transwell小室实验、流式细胞术分别检测miR-218-5p对U251细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。3.利用生物信息学方法预测并筛选出miR-218-5p的靶基因HMGB1。通过qRT-PCR法检测HMGB1在胶质瘤组织及细胞中的表达。利用双荧光素酶靶基因报告实验验证miR-218-5p与HMGB1的靶向关系。4.构建裸鼠皮下胶质瘤移植模型及Wistar大鼠颅内原位胶质瘤模型,通过瘤内注射agomir-218-5p过表达miR-218-5p,通过头颅能谱CT扫描观察肿瘤大小,HE染色观察病理学改变,Western Blot和免疫组化检测HMGB1以及增殖相关蛋白的表达。结果:1.通过GEO数据筛选出目的miRNA为miR-218-5p,通过QRT-PCR分析结果显示miR-218-5p在胶质瘤及正常脑组织中差异表达,在胶质瘤中表达下调。胶质瘤中miR-218-5p的表达水平与胶质瘤患者预后相关,miR-218-5p低表达提示胶质瘤患者预后不良。2.CCK-8细胞增殖实验显示miR-218-5p能够抑制胶质瘤细胞的增殖。3.细胞划痕愈合实验及Transwell小室实验结果显示miR-218-5p能够抑制胶质瘤细胞侵袭及迁移。4.流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示miR-218-5p能诱导胶质瘤细胞凋亡。5.预测表明HMGB1可能是miR-218-5p的靶基因,HMGB1在胶质瘤中明显上调表达。双荧光素酶靶基因验证实验结果显示,miR-218-5p可能通过与HMGB1 mRNA 3'UTR上的位点结合调控基因的表达。6.动物体内实验结果显示miR-218-5p在体内靶向抑制HMGB1的表达抑制裸鼠皮下胶质瘤的生长。结论:miR-218-5p在胶质瘤组织中表达下调,通过靶向调控HMGB1的表达抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭及迁移,并诱导其凋亡。在体内miR-218-5p靶向调控HMGB1抑制胶质瘤生长。
【图文】：

miR-218-5p 靶向调控 HMGB1兰州大学硕士学位论文 对胶质瘤的抑制作用及机制研究进行数据分析，使用 GraphPad Prism 7 软件作图。数据用平均值±标准差形式表示。两组间差异比较用独立样本 t 检验，患者生存曲线使用 Kaplan-Meier 法绘制，使用对数秩检验进行统计分析。P<0.05 表示存在统计学差异。1.4 实验结果1.4.1 生物信息学筛选胶质瘤中差异表达 miRNA通过对 NCBI 胶质瘤 GEO 数据分析，选取在正常脑组织及不同级别胶质瘤中具有差异表达的 miRNA,进行热图聚类后的结果如图（图 1-1）所示。结果显示，miR-218-5p 在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达具有明显差异，在胶质瘤组织中呈下调表达，并随着胶质瘤级别的增加其表达量逐渐减低。

图 1-2 miR-218-5p 在正常脑组织和胶质瘤中的表达1.4.3 miR-218-5p 的表达水平与胶质瘤患者预后相关对纳入研究的 66 例患者进行电话随访，术后随访时间在 9~69 个月之间，，平均随访时间（22.4±6.7 月）。通过绘制患者的生存曲线（Kaplan-Meier 法）显示，miR-218-5p 低表达的患者的总生存期显著低于高表达的患者。同样，miR-218-5p低表达患者的无进展生存期显著低于高表达的患者。表明 miR-218-5p 在胶质瘤组织中的表达水平与胶质瘤患者的预后显著相关（P <0.001；图 1-3）。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.41

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