RAB39B基因突变导致X连锁遗传帕金森综合征分子遗传学及机制研究

发布时间：2020-05-21 12:12

【摘要】：背景帕金森病(Parkinson’s Disease)是一种常见的中老年慢性神经退行性疾病。青少年型帕金森综合征(Juvenile Parkinsonism,JP)是一种非常罕见的遗传性PD。患者大多于青少年时期发病,一般早于21岁,主要临床表现为进展较为缓慢的震颤、肌肉强直、运动迟缓和姿势不稳等帕金森综合征症状,多巴胺替代治疗效果良好。目前已发现20余种单基因突变与JP相关。Pakin、Pink1和DJ-1基因突变可导致具有单纯帕金森综合征症状的JP,而携带PLA2G6、ATP13A2和DNAJC6基因突变的患者除了具有帕金森综合征症状外,还可伴随言语障碍、锥体束征和构音障碍等不典型症状。RAB39B基因位于X染色体上,编码一种囊泡转运相关蛋白,该基因突变可导致伴有认知功能障碍的早发型PD。目前,在中国汉族人群中尚无RAB39B基因突变导致JP的报道。目的我们在前期工作中收集到1个JP家系,通过全外显子组测序(Whole exome sequencing,WES)技术,明确该家系的致病基因,了解RAB39B基因突变在中国散发性PD人群中的流行特点,并初步探究其在PD发病机制中的作用。方法1.本研究纳入1个JP家系和505名在郑州大学第一附属医院就诊的散发性PD患者。所有患者均完善相关检查,并由两名神经内科专科医师进行详细的体格检查和诊断。同时,纳入510名性别、年龄与病例组匹配的健康对照。所有研究对象均知情同意,登记临床资料、抽血及定期随访。2.对该家系的2名男性患者进行WES,对测序结果进行后期分析验证,明确其致病基因。3.利用Sanger测序,在家系内所有成员进行RAB39B基因突变位点的验证;在本地区散发性PD和正常人群中进行RAB39B基因突变的筛查。4.构建含有本研究发现的致病突变位点的真核表达载体,利用脂质体转染、Real-time PCR、Western-blot及免疫荧光等技术来明确突变型RAB39B的表达水平及RAB39B对自噬功能和α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)的影响。结果1.该家系两名男性患者表现为青少年时期出现的肢体震颤、行动迟缓及肌强直等症状,伴随不同程度的认知功能障碍。患者的头颅磁共振成像(Magneticresonance imaging,MRI)、计算机断层扫描(Computed tomography,CT)结果显示双侧基底节对称性的钙化。先证者之父及家系中女性成员均表现正常,符合X染色体连锁的遗传规律。2.根据WES结果,共筛选出31个两名患者共同携带的可疑致病变异,其中RAB39B(c.536dupA)突变最有可能为致病突变。3.经过Sanger测序验证,该家系中患者Ⅱ-2和Ⅲ-1为RAB39B基因c.536dupA半合子突变。先证者母亲Ⅱ-3为RAB39B基因c.536dupA杂合突变。家系中其他正常成员Ⅱ-1、Ⅱ-4及Ⅱ-5不携带该突变。RAB39B基因c.536dupA突变与临床表型共分离。在本地区散发性PD和正常人群中未发现RAB39B基因新的致病突变。4.成功构建含有RAB39B基因(c.536dupA)突变型载体pcDNA3.1-HA-RAB39B-536。在N2a细胞模型中,突变型RAB39B的转录水平约为野生型RAB39B的2倍,而突变型RAB39B的蛋白水平明显低于野生型,加入MG132后突变型RAB39B蛋白水平有所升高。5.RAB39B基因(c.536dupA)突变组的LC3BⅡ/Ⅰ值显著低于野生组。6.RAB39B蛋白可能与α-Syn存在体内相互作用关系。过表达野生型和突变型的RAB39B不影响内源性α-Syn的蛋白水平,而过表达野生型的RAB39B会导致外源性的野生型和突变型(p.A53T)α-Syn蛋白水平升高。结论1.首次在中国汉族人群中发现RAB39B基因c.536dupA突变所导致的X染色体连锁遗传的JP。RAB39B基因突变不是PD常见的发病原因。2.首次发现RAB39B基因c.536dupA突变可导致患者出现双侧基底节区明显的钙化,扩展了RAB39B基因突变所导致的PD的临床表型。3.RAB39B基因c.536dupA突变型蛋白稳定性下降,突变型蛋白可能通过泛素-蛋白酶体通路降解。4.RAB39B基因c.536dupA突变可能影响细胞的自噬水平。5.RAB39B蛋白可能与α-Syn存在体内相互作用关系,可能参与α-Syn的稳态水平的维持。
【图文】：

家系图,帕金森综合征,家系图,神经内科

法，我们在郑州大学第一附属医院神经内科收集了患者（先证者及先证者之舅）表现为青少年时帕金森综合征症状，同时伴随不同程度的认知庭成员表现均正常，符合 X 染色体连锁的遗传共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)及graphy, CT)等检查，同时有两名神经内科专科医的 6 名成员均同意登记临床资料、抽血及定期随

实验流程,外显子,测序,文库

图 1.2 全外显子组测序实验流程[31]样本检测组 DNA 总量在 10μg 以上，浓度 50ng/μl 以上，A260/A280 的值在 1采用 Agilent Sureselect 方法制备测序文库[32]NA 文库准备：使用 Covaris S2 超声仪将基因组 DNA 片段化→修复→在末端已修复的 DNA 片段 3’末端加上“A”碱基→将特定的测NA 片段末端→将加上测序接头的 DNA 片段利用 PCR 进行扩增。均需用 Agencourt AMPure XP 磁珠纯化样本。测定 DNA 文库浓度文库杂交：将待杂交样本与 SureSelect 靶向富集系统在液相A 的形式进行杂交。用 Dynal 磁珠捕获杂交的 DNA 片段。将未结合的 DNA 片段除去，，A 酶消化。PCR 扩增捕获的 DNA 片段并纯化。检测文库质量后上机。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5

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