胶质瘤患者新型miRNA的鉴定与功能研究

发布时间：2020-05-22 18:25

【摘要】：目的:多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是目前最常见的中枢神经系统原发性肿瘤,可发生于任何年龄,约占所有颅内肿瘤的15%,具有恶性程度高、侵袭性强的特性。同时,GBM具有高度异质性,预后极差,临床上针对特定分子靶标或亚型进行精准诊疗尤为重要。转化生长因子-β(transforming growth factor-βTGF-β)信号途径通过其肿瘤抑制或促进机制在肿瘤发生发展中起重要作用。近年来,有研究提出TGF-β通过microRNA(miRNA)调节影响信号传导过程。miRNA与TGF-β信号通路之间存在自动调节的反馈环路,通过相互调节作用关系影响着肿瘤细胞的生物进程。我们利用转化生长因子-β受体(transforming growth factor-βreceptor,TGF-βR)小分子抑制剂对新鲜切除的临床组织样本进行药物处理,利用高通量测序的方法比较了加药处理组和对照组间miRNA表达谱的差异。在测序结果中我们意外地发现了部分新型miRNA,并在处理和对照组之间存在显著的统计学差异。本研究旨在对所发现的显著差异的新型miRNA进行筛选鉴定,阐明一新型miRNA在TGFβ信号传导通路调控间的关系以及在胶质瘤中的作用。研究方法:利用高通量测序结合stem-loop qRT-PCR(茎环法引物设计)和生物信息学方法对新型miRNA进行验证和分析。基于人脑胶质细胞瘤细胞系U87、原代细胞和胶质母细胞瘤的PDX小鼠模型,通过靶基因生物信息学分析预测和双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR及Western blot筛选验证靶基因,经模拟物(mimics)或慢病毒转染进行体外功能机制研究和体内动物实验。研究结果:1.在测序结果分析中我们发现在相应的处理组和对照组间有27个新型miRNA表达存在显著差异,通过stem-loop qRT-PCR验证筛选出novel_miR 56作为新型miRNA具有显著差异且受TGF-β通路调控。2.通过靶基因预测并分析novel_miR 56可能参与的生物学进程,综合分析我们筛选出了PRAS40作为novel_miR 56的可能靶mRNA。通过下游靶基因相关实验验证,我们发现在胶质瘤细胞中,novel_miR 56可通过与野生型PRAS40 mRNA的3`UTR特异性结合,调控PRAS40的mRNA和蛋白水平变化,从而证实了PRAS40是novel_miR 56的天然靶基因。3.体外增殖实验显示novel_miR 56过表达促进肿瘤的生长,并通过mTOR信号通路作用于细胞自噬并影响增殖。4.体内动物实验表明,novel_miR 56过表达组较对照组的肿瘤大小及增长速度明显增加,生存时间短。免疫组化结果显示novel_miR 56过表达组具有更高的恶性程度,novel_miR 56促进了肿瘤的发展。结论:我们的研究结果验证了在胶质瘤中,novel_miR 56作为oncomiR起作用,我们确定了TGFβ-novel_miR 56途径的下游靶标是PRAS40 mRNA,其翻译蛋白是mTOR激酶的负调节因子,通过mTOR信号通路进而影响细胞自噬。体内外实验均表明novel_miR 56在减弱细胞自噬水平后促进了肿瘤细胞增殖。同时,我们的研究也提供了一种新的机制来解释TGFβ信号传导在胶质瘤中的促癌作用。
【图文】：

25通量测序 miRNA 差异表达分析结果（绿色圆点代表显著圆点为显著上调基因，灰色圆点为差异无显著性基因）证，我们选取差异显著下调的 7 个新型 miRNA（noovel_miR68、novel_miR93、novel_miR97、novel_miR116、noqRT-PCR 技术进行验证，并比较所选 novel_miRs 在各个细我们发现最终有 5 个新型 miRNA（novel_miR26、noovel_miR97、novel_miR119）被检测到，其中 novel_miR56、n较高（见图 2-2）。

图 2-2 不同细胞系（株）中各 miRNA 的相对表达丰 miRNA 的测序结果，，我们采用与测序样本相同的处09761 对细胞进行药物处理，通过对 U87、N9、LN22loop qRT-PCR 验证结果的分析发现只有 novel_miR56中的变化趋势与测序结果一致，而 novel_miR26、不同细胞间验证结果差异较大（见图 2-3）。
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.4

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