TMEM106B影响恶性脑膜瘤增殖和血管生成的体内实验及分子机制的研究

发布时间：2020-05-25 13:22

【摘要】：目的:本实验旨在通过体内实验验证TMEM106B对恶性脑膜瘤细胞增殖和血管生成的影响,并探讨其可能分子机制。方法:1.干扰恶性脑膜瘤IOMM-Lee和CH157两种细胞株TMEM106B基因,每组细胞株分为三组:干扰TMEM106B为实验组(TMEM106B-sh),转染无关序列慢病毒为阴性对照组(NC-sh),空白对照组(Blank),使用q-PCR、Western blot方法检测各组细胞TMEM106B mRNA和蛋白表达水平。2.体内裸鼠成瘤实验绘制IOMM-LEE、CH157两种恶性脑膜瘤细胞株瘤体生长-时间曲线,计算抑瘤率,并且通过免疫组化法检测各组瘤体中ki-67和VEGF的表达情况,并通过标记CD34来计算其微血管密度(MVD),比较各组细胞增殖和血管生成能力。3.通用软件预测分析TMEM106B基因启动子与转录因子JUN之间的结合位点,并构建TMEM106B报告基因野生型、突变型质粒及转录因子JUN的过表达质粒,通过双荧光素酶报告基因实验验证转录因子JUN是否能与TMEM106B启动子特异性结合。4.染色质免疫沉淀(CHIP)实验进一步验证TMEM106B基因启动子与转录因子JUN之间是否有特异性的结合。结果:1.通过慢病毒转染干扰TMEM106B基因的表达后,q-PCR、Western blot检测发现恶性脑膜瘤细胞株中TMEM106B的蛋白及mRNA的表达水平明显下降,达到分组要求。2.裸鼠成瘤实验中,在TMEM106B-sh组,裸鼠成瘤的能力减弱,瘤体增殖的速度减慢,免疫组化染色结果显示TMEM106B、ki-67、VEGF表达水平均明显下降,差异具有统计学意义。标记各组CD34的表达水平分析各组的微血管密度(MVD),结果显示干扰TMEM106B后,MVD降低。3.软件预测分析结果显示:TMEM106B基因启动子区上有7个转录因子JUN的结合位点,双荧光素酶报告基因实验结果显示,转录因子JUN能与TMEM106B启动子区特异性结合。4.染色质免疫沉淀(CHIP)实验结果显示TMEM106B启动子能与转录因子JUN结合。结论:1.干扰TMEM106B后可以抑制恶性脑膜瘤的增殖和血管生成;2.MEM106B启动子区存在与转录因子JUN结合的特异性位点,说明TMEM106B可能受JUN的调控影响恶性脑膜瘤的增殖与血管生成。
【图文】：

细胞株,恶性脑膜瘤,表达水平,基因

图2-1：Q-PCR检测两株恶性脑膜瘤细胞株TMEM106B基因 mRNA的表达水平（**P＜0.01，***P＜0.005）2.2.3 Western blot 检测恶性脑膜瘤细胞 TMEM106B 基因蛋白的表达情况提取各组蛋白进行 Western blot 检测，结果如下图（图 2-2）所示，说明在IOMM-LEE 细胞株、CH157 两株细胞株中，沉默 TMEM106B 后 TMEM106B 蛋白表达量均下降，IOMM-Lee细胞株下降约53.9%，CH157细胞株下降约55.6%，，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

时间曲线,细胞株,裸鼠,恶性脑膜瘤

EM106B 基因后对恶性脑膜瘤细胞增殖和血管生成的影响23图2-2: Western blot检测两株细胞株TMEM106B基因蛋白表达水平（**P＜0.01，***P<0.005）2.2.4 裸鼠的生长-时间曲线接种恶性脑膜瘤第 6 天后，各组裸鼠均可在腋下触及实性包块，几天后包块未消失，裸鼠成瘤率为 100%，无自然死亡。记录裸鼠瘤体的 a 值、b 值，计算体积，结果显示：裸鼠成瘤第 6 天开始，各组之间的体积出现的变化，两株细胞株中 TMEM106B-sh 组与 NC-sh 组比较
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.45

【参考文献】