内皮细胞分泌的外泌体增强神经祖细胞活性并在急性MCAO中促进神经修复的研究

发布时间：2020-05-26 04:28

【摘要】：目的:相关研究证实,外泌体参与细胞间通讯并调控靶细胞的相关行为。数据表明,脑微血管内皮细胞可分泌外泌体。因此,本研究旨在进一步探讨内皮细胞外泌体对神经祖细胞生存活性的影响,并在MCAO模型中进一步验证,从而为卒中后损伤区神经功能重建提供新的思路及潜在的临床治疗手段。方法:1.分离培养野生型小鼠的神经祖细胞(NPC),用干细胞专用培养基对其进行培养,待纯化后利用免疫荧光法鉴定其表面特异性抗原。2.用超速离心的方法提取鼠源微血管内皮细胞(bEnd.3)的外泌体,并通过透射电镜,Western blot,动态光散射进行鉴定,分别使用不同浓度培养NPCs,利用CCK8试剂,Edu试剂盒检测其对NPCs增殖能力的影响;利用Trans-well,细胞划痕实验检测外泌体对NPCs迁移能力的作用;在营养因子剥夺的环境中,外泌体处理3h通过FACS/PI检测其对NPCs细胞凋亡的影响,采用Western blot进一步检测各类凋亡蛋白的表达情况。3.MCAO造模成功后,通过颅内立体定位仪在侧脑室注射100uL,100ug/mL的外泌体或PBS,分别在第1,3,7,14,21天进行行为学的评定,第1天和21天通过颅脑磁共振检测动物的病变情况,并分别统计脑梗死体积。结果:神经祖细胞特异性抗体Sox2、Nestin双标成功鉴定提取的细胞;通过Edu,Dapi染色证明了内皮细胞可促进神经祖细胞的增殖和迁移,且与内皮细胞的数量成正比。透射电镜下外泌体形态为椭圆形或圆形,直径大小为30-150nm。Western Blot检测显示内皮细胞培养上清液和外泌体TSG101、Alix、Flotillin-2蛋白均表达阳性。动态光散射分析分离所得细胞外囊泡大小分布均在30-200nm范围内。在加入的外泌体浓度为60ug/mL的条件培养基中,明显能促进NPCs的增殖和迁移,并抑制其凋亡。通过TTC染色确定MCAO模型构建成功,磁共振结果显示造模后第1天和21天颅内立体定位注射外泌体组的动物比注射PBS组的动物脑梗死体积有所减小,catwalk评估显示外泌体组的动物比PBS组的动物行为学结果要好。结论:内皮细胞的外泌体具有促进神经祖细胞的增殖和迁移,并抑制其凋亡的功能,并且在大脑中动脉闭塞模型中验证内皮细胞的外泌体可改善脑梗死后动物的神经功能修复,这可能是一种潜在的临床治疗手段。
【图文】：

细胞,阳性率,标志物,图片

神经祖细胞细胞球经过消化后，铺板于经过1% PDL 包被过的载玻片上，待其贴壁培养15 min后，经过4%PFA室温孵育细胞固定后，进行神经祖细胞标志物Sox2和Nestin的细胞免疫荧光染色，在普通的荧光显微镜下观察细胞染色情况。图1（A-D）分别为Nestin、DAPI、Sox2及三者共染的荧光图片。经统计分析后得出，，Sox2的阳性率为98.28%±1.69%，Nestin 的阳性率为98.86%±2.16%并且Nestin和Sox2共标的细胞阳性率为98.28%±1.69%。根据相关报道的鼠源神经祖细胞的数据显示，本实验提取、培养的原代鼠源神经祖细胞的纯度比较高且符合使用标准。图1：鼠源神经祖细胞的鉴定。A 为免疫荧光显示Nestin（红色）染色阳性细胞，B所示 DAPI为细胞核染色阳性标志物，C所示为 Sox2（绿色）染色阳性细胞，所有图片标尺均为50 μm。2 脑微血管内皮细胞(bEnd.3)促进神经祖细胞(NPCs)的增殖和迁移利用trans-well模式进行bEnd.3细胞和NPCs的共培养。实验组为bEnd.3细胞在trans-well上腔接种，NPCs接种于下腔

共培养,细胞,对照组

21值，从而得出bEnd.3细胞能够促进NPCs增殖, 对照组和实验组使用Edu试剂盒有显著差异（P <0.01）。（图2A-C）。类似地，将bEnd.3细胞接种于trans-well下腔，NPCs细胞接种于上腔，对照组则只在上腔接种NPCs，培养3天后，通过DAPI染色，荧光显微镜下随机拍摄不同视野，经统计分析得出bEnd.3细胞能显著促进NPCs的迁移，差异具有统计学显着性（P <0.01）（图2D-F）。综上所述
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.3

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