何首乌活性成分二苯乙烯苷对神经干细胞分化为DA能神经元的作用及机制

发布时间：2020-05-26 05:09

【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的、与衰老密切相关的神经系统退行性疾病。PD主要的病理特征是中脑黑质(Substantia nigra,SN)致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神经元进行性退变坏死,引起纹状体部位DA含量下降。目前临床治疗PD的方法主要包括药物治疗和手术治疗,但这些治疗手段只能缓解症状,仍不能有效改变由于神经元进行性退变死亡引起的系统功能障碍。因此寻求理想的治疗手段以补充缺失DA能神经元迫在眉睫。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一类具有高度自我更新能力的细胞。NSCs在增殖和迁移的过程中具有多向分化潜能,可以分化为DA能神经元,被誉为是治疗PD最具有应用前景的种子细胞。然而,目前常规诱导NSCs向DA能神经元分化方案效率较低、步骤繁琐而且不稳定,故很大程度限制了其在PD治疗中的应用。二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)是传统中药何首乌(Polygonum multiflorum thunb,PM)的主要活性成分,大量研究表明TSG具有促进神经营养因子分泌和神经保护作用,但TSG能否有效诱导NSCs向DA能神经元方向分化的作用尚不清楚。本课题以小鼠中脑腹侧NSCs为切入点,观察了TSG诱导中脑NSCs定向分化为DA能神经元的作用,采用细胞和分子生物学等技术,从形态特征和生化表型对分化产生的DA能神经元进行鉴定。目前诱导NSCs定向分化机制尚不清楚,本实验将探明TSG促进NSCs分化为DA能神经元的Wnt/β-catenin信号传导通路,为临床治疗PD等神经退变性疾病的中药联合细胞治疗及组织工程提供新的思路和实验依据。【目的】1.探讨中药何首乌活性成分TSG诱导NSCs定向分化为DA能神经元的作用,获得有生化表型和有细胞功能的成熟DA能神经元。2.阐明TSG诱导NSCs定向分化为功能性DA能神经元Wnt/β-catenin分子调控机制。【方法】1.中脑NSCs分离、培养和鉴定:取孕12d的Balb/c小鼠胚胎中脑腹侧组织,体外分离和DMEM/F12无血清(含有20ng/ml的EGF和FGF,1%N2)培养,细胞Nestin免疫荧光染色鉴定。2.EdU标记:EdU标记检测NSCs增殖情况。3.TSG处理:去除生长因子刺激,将不同浓度的TSG(0,0.5,1,5,10,20μM)添加到培养基里进行NSCs分化诱导。4.流式细胞检测:检测TSG对NSCs的作用。5.免疫荧光染色:在不同条件诱导后,进行Tuj-1、GFAP、CNPase、TH、DAT、和Nurr1等的染色并观察细胞染色情况以及细胞形态变化情况。6.Western Blot:定量分析Tuj-1、GFAP、CNPase、TH、DAT、Nurr1、Wnt1,Wnt3a,Wnt5a和β-catenin等蛋白的表达水平,比较不同诱导条件下这些分子表达变化。【结果】第一部分:中脑来源的神经干细胞体外分离、培养、增殖和细胞分化的研究1.细胞培养7d后可形成呈悬浮生长的“神经球”,随着培养时间延长神经球不断增多,体积也逐渐增大,经Nestin免疫荧光染色显示均呈阳性,证明培养的细胞为NSCs。2.EdU染色结果:随着培养时间延长,EdU阳性细胞数量在不断增加,5d EdU阳性细胞数量达到最高。3.免疫荧光染色结果显示:采用常规含2%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)诱导方案对培养的NSCs进行诱导,12h后细胞形态由球形逐渐变成多角形,并且有突起延伸,7d后,视野里细胞呈现不同形态,有些胞体立体感强,有的折光性好,有的细胞呈扁平形。经Tuj-1、GFAP和CNPase免疫荧光染色发现,这些分化的细胞中,GFAP阳性细胞数量最多,Tuj-1次之,CNPase阳性细胞最少,表明所培养的NSCs具有多分化潜能。而无血清对照组细胞贴壁速度较慢,没有明显的Tuj-1、CNPase、GFAP阳性细胞出现,视野里大部分细胞呈现退化状态。4.采用2%FBS诱导中脑NSCs分化,我们可以观察到Tuj-1和GFAP阳性反应细胞,随着分化时间的延长,Tuj-1阳性细胞数目不断增加,诱导分化2w后达到最高值,但是GFAP阳性细胞数目一直升高。第二部分:二苯乙烯苷对中脑神经干细胞存活、凋亡和分化的作用,及其相关的Wnt/β-catenin信号分子机制1.流式细胞检测结果表明:在5个不同浓度TSG(0.5,1,5,10,20μM)诱导组中,TSG(1,5,10μM)组中脑NSCs存活数目较多,细胞凋亡较少,其中10μM TSG作用最佳,与对照组相比有显著性差异(P0.01)。2.免疫荧光染色和Western blot检测结果显示:i 10μM TSG+2%FBS诱导NSCs分化2w,在分化细胞中,Tuj-1阳性细胞数目和蛋白表达相对于2%FBS对照组明显增加,而GFAP和CNPase阳性细胞数目和蛋白表达减少,经统计学分析有显著性差异(P0.01)。10μM TSG组作用与10μM TSG+2%FBS组在促NSCs分化效果相似。而空白对照组(不加任何诱导剂),没有明显的细胞分化,未检测到Tuj-1、GFAP和CNPase阳性细胞及蛋白表达。ii在对DA能神经元三个特异性标记蛋白检测中,研究发现10μM TSG+2%FBS诱导NSCs分化2w,分化的细胞中TH、DAT和Nurr1阳性细胞数目和蛋白表达水平增加,单独TSG作用与TSG+2%FBS组效果相似,这两组与2%FBS组相比都有显著性差异(P0.01),而空白对照组(没有任何诱导剂)没有明显的阳性细胞出现和蛋白表达。3.TSG诱导NSCs分化的机制:Western blot检测结果表明:同样地,在以上相同的处理组中,10μM TSG+2%FBS诱导可明显的提高分化的细胞中Wnt1、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白表达水平,单独TSG作用与TSG+2%FBS组效果相似,这两组与2%FBS组相比都有显著性差异(P0.01)。而空白对照组(不加任何诱导剂),没有明显的细胞分化,未检测到Wnt1、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白表达。而给予Wnt信号阻断剂IWR1处理,倒置相差显微镜下观察可以看到NSCs增殖速度明显升高,细胞迁移和分化能力明显降低。流式细胞检测显示:加入IWR1阻断剂明显抑制NSCs的存活,表现为细胞存活数目降低,凋亡数目增加,与未加入IWR1阻断剂的10μM TSG组相比有显著性差异(P0.01)。此外,免疫荧光染色结果表明:IWR1阻断剂组分化的细胞中Tuj-1和TH双标阳性细胞数目明显少于未加入IWR1阻断剂10μM TSG组,统计学分析显示有显著性差异(P0.01)。【结论】1.采用常规的含2%FBS培养基可以诱导NSCs可分化为三种细胞类型:神经元(Tuj-1~+)、星形胶质细胞(GFAP~+)和少突胶质细胞(CNPase~+)。NSCs向神经元方向分化的最佳时间为2w。而无血清诱导条件的细胞不能正常分化,呈现退化状态。2.一定浓度的TSG可以促进中脑NSCs存活,减少细胞凋亡,10μM TSG作用效果最佳。另一方面,与2%FBS对照组相比,TSG可以促进NSCs分化为更多的DA能神经元,且能够表达DA能神经元TH、DAT和Nurr1等标志性markers,表明NSCs分化产生的细胞具有成熟DA能神经元的形态特征。3.TSG诱导中脑NSCs定向分化为DA能神经元作用机制可能是通过激活Wnt/β-catenin分子信号通路而实现。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5

【参考文献】